Læs HPLC-renhed og CoA for peptider korrekt
Dr. Sieglinde Klaus
Videnskabelig redaktion · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Videnskabelig redaktion · Bergdorf Bioscience
HPLC-renheden angiver, hvor stor en procentuel arealandel af et kromatogram der tilfalder målpeptidet, mens Certificate of Analysis (CoA) dokumenterer denne værdi sammen med identiteten bekræftet ved massespektrometri, batchen og analysemetoderne. En værdi på >=99% betyder, at kun et meget lille areal af UV-detektorsignalet tilfalder bikomponenter. Denne guide forklarer, hvordan begge angivelser opstår, og hvordan du kontrollerer dem.
Højtryksvæskekromatografi (HPLC) adskiller en opløst peptidblanding efter fysisk-kemiske egenskaber og synliggør dermed, hvor mange komponenter en prøve består af. I peptidanalysen dominerer omvendt-fase-HPLC (RP-HPLC) på C18-, C8- eller C4-søjler, fordi den adskiller molekyler efter deres hydrofobicitet og samtidig leverer en høj separationsskarphed. Ifølge metodeoversigten fra Mant et al., 2007 har HPLC i over 25 år været anset for at være den mest alsidige metode til isolering og renhedsbestemmelse af syntetiske peptider.
Konkret løber en mobil fase, oftest en gradient af vand og acetonitril med 0,05 til 0,1% trifluoreddikesyre (TFA), gennem søjlen. Hver komponent forlader søjlen på et karakteristisk tidspunkt, retentionstiden, og frembringer en peak på UV-detektoren (typisk 214 eller 220 nm, hvor peptidbindingen absorberer). HPLC måler altså ikke identiteten af et stof, men dets separationsadfærd og relative mængdeandel. For en udtalelse om identiteten kræves en anden metode, massespektrometrien.
Procentangivelsen for HPLC-renheden beskriver arealandelen af hovedpeaken i forhold til det samlede areal af alle detekterede peaks. Ved 99% tilfalder altså 99% af det integrerede UV-signalareal målpeptidet og kun 1% samtlige bikomponenter tilsammen. Det er vigtigt, at der er tale om en relativ arealangivelse og ikke en vægtangivelse: restopløsningsmidler, salte eller vand, som næsten ikke absorberer ved 214 nm, indgår ikke i denne værdi. Derfor supplerer seriøse producenter HPLC-renheden med yderligere nøgletal som nettopeptidindholdet.
Bikomponenterne stammer som regel fra fastfasesyntesen. Ifølge Boysen & Hearn, 2006 opstår der ved den trinvise syntese især deletionssekvenser (en manglende aminosyre), afkortede sekvenser samt produkter fra ufuldstændig afbeskyttelse eller racemisering. Netop disse kemisk meget lignende urenheder er svære at adskille og bestemmer, hvor høj den opnåelige renhed bliver. Et spring fra 95% til 99% betyder derfor, at disse beslægtede komponenter i vidt omfang er fjernet. Mere baggrund om selve stofklassen finder du i guiden Hvad er peptider?.
Et CoA er analyseprotokollen for en konkret batch og samler resultaterne af alle gennemførte analyser i ét dokument. Typisk angiver det produktnavnet, summeformlen og den teoretiske molekylvægt, batchnummeret, fremstillings- eller analysedatoen samt de anvendte metoder. Kernen udgøres af to blokke: identitetsbekræftelsen ved massespektrometri og renhedsbestemmelsen ved HPLC. Ofte er der desuden angivet et udseendebefund (hvidt lyofilisat) og vandindholdet.
Det afgørende er, at et troværdigt CoA viser originaldataene og ikke blot påstår et tal. Hertil hører det afbildede HPLC-kromatogram med retentionstid og integrationsarealer samt massespektret med den målte m/z-værdi. På den måde kan en fagkyndig person efterprøve udsagnene i stedet for blot at tro på dem. Metodeangivelserne bør være præcise, eksempelvis søjletype, gradient, detektionsbølgelængde og det anvendte ioniseringsprincip. Hos BergdorfBio fungerer det batchrelaterede CoA som dokumentation for det >=99% HPLC- og CoA-løfte, der nævnes på forsiden. Produkter som BPC-157 eller Retatrutid leveres hver især med et sådant dokument til batchen.
Mens HPLC kun viser separationsadfærden, besvarer massespektrometrien spørgsmålet om, hvorvidt det rigtige molekyle er til stede. I peptidanalysen dominerer elektrospray-ionisering (ESI), et skånsomt ioniseringsprincip, der overfører molekyler til gasfasen uden fragmentering. Ifølge Banerjee & Mazumdar, 2012 frembringer ESI flerladede ioner, hvorved det målbare m/z-område udvides betydeligt, så også store peptider kan bestemmes præcist.
På CoA'et stilles den målte molekylvægt over for den teoretiske værdi, der er beregnet ud fra summeformlen. Stemmer begge overens ned til få masseenheder, er peptidets identitet bekræftet. En afvigelse på eksempelvis 18 masseenheder kunne tyde på et vandtab, en større forskel på en forkert eller forurenet sekvens. Koblingen af begge metoder, altså LC-MS, er særligt udsigelseskraftig: Toll et al., 2005 viste, at over 50 peptider fra en tryptisk fordøjelse kunne adskilles på 15 til 20 minutter og samtidig identificeres ved ESI-MS. Identitet og renhed registreres på den måde i ét gennemløb.
Kromatogrammet er den grafiske kerneudsagn i ethvert CoA: på x-aksen står tiden i minutter, på y-aksen detektorrespons, oftest i milliabsorptionsenheder (mAU). Målpeptidet fremstår som en høj, smal hovedpeak ved sin karakteristiske retentionstid, eksempelvis ved 8 til 12 minutter afhængigt af metoden. En rent forarbejdet prøve viser en enkelt, skarp og symmetrisk peak med tydelig basislinjeadskillelse til eventuelle bipeaks.
Når du læser kromatogrammet, skal du være opmærksom på tre ting. For det første peakformen: en stærkt skæv peak (tailing) eller en udbredt basis kan tyde på samuderende urenheder eller søjleproblemer. For det andet små bipeaks: disse står for synteseprodukter, og deres arealsum udgør den manglende procentandel op til 100%-mærket. For det tredje basislinjen: den bør forløbe flad og rolig uden drift. Integrationen, altså den beregningsmæssige arealbestemmelse under hver peak, leverer til sidst procenttallene. En TFA-holdig mobil fase forbedrer samtidig peakskarpheden, da TFA som ionpar-reagens maskerer peptidets basiske sidekæder og dermed frembringer en mere homogen elueringsadfærd (Mant et al., 2007).
En enkelt procentangivelse uden kontekst er ikke meget værd, fordi den er metodeafhængig. Den samme prøve kan på to forskellige søjler eller ved to detektionsbølgelængder give let forskellige værdier, da separationen og UV-absorptionen af bikomponenterne varierer. En renhed på 99%, målt ved blot én bølgelængde, overbeviser først, når metoden er fuldt dokumenteret, og det tilhørende kromatogram er vedlagt. Et nøgent tal uden spektrum kan ikke efterprøves.
Dertil kommer, at HPLC-renheden ikke registrerer UV-inaktive bestanddele. Salte fra syntese- og rensningsprocessen, eksempelvis acetat- eller trifluoracetat-modioner, samt restvand bidrager med masse uden at dukke op i kromatogrammet. Derfor er nettopeptidindholdet, ofte bestemt ved aminosyreanalyse eller kvælstofbestemmelse, et fornuftigt supplement: det fortæller, hvor meget rent peptid der faktisk er indeholdt pr. milligram pulver. Identitet (MS), relativ renhed (HPLC) og absolut indhold er tre forskellige spørgsmål, som et godt CoA besvarer hver for sig.
Hver synteseserie er en selvstændig kemisk proces med sine egne udsving, og derfor skal et CoA altid være tilknyttet en konkret batch. Et generisk datablad, der skal gælde for alle nogensinde producerede enheder af et produkt, er ikke et analysebevis, men en reklameudtalelse. Først batchnummeret på dokumentet forbinder de målte værdier med det fysiske materiale i hætteglasset foran dig. Retentionstiden, massespektret og renheden gælder netop for denne produktionsenhed.
Det er også relevant, fordi urenhedsprofilen kan variere mellem batches. Én batch når måske 99,2%, en anden 98,6% med et let anderledes bipeakmønster. Kun et batchbundet CoA afspejler denne virkelighed. I praksis bør du sammenholde batchnummeret på etiketten med det på CoA'et, kontrollere analysedatoen og sikre dig, at kromatogrammet faktisk er vedlagt. Mangler batchtilknytningen eller originaldatabladet, kan renhedsangivelsen ikke efterprøves, uanset hvor højt tallet er.
De små peaks ved siden af hovedpeaken er ikke tilfældige, men har definerede kemiske årsager. Fra fastfasesyntesen stammer især deletionspeptider, hvor en aminosyre er blevet udeladt under opbygningen, samt afkortede sekvenser på grund af for tidligt kædeafbrud. Derudover optræder produkter af ufuldstændig afbeskyttelse, hvor beskyttelsesgrupper forbliver på molekylet, samt racemiseringsprodukter med ændret stereokemi. Disse beslægtede komponenter adskiller sig ofte kun minimalt fra målpeptidet og elueres tilsvarende tæt på hovedpeaken.
Efter opbevaring kan der komme yderligere nedbrydningsprodukter til. Ifølge oversigten fra Lai & Topp, 1999 hører deamidering, spaltning af peptidbindingen, oxidation, Maillard-reaktionen, beta-eliminering og aggregering til de vigtigste kemiske reaktioner i fast tilstand. I kromatogrammet kommer sådanne processer til udtryk som nye eller voksende bipeaks. Et CoA udarbejdet direkte efter syntesen dokumenterer derfor udgangstilstanden, mens den faktiske profil i forskningslaboratoriet desuden afhænger af håndtering og opbevaring.
Den renhed, der er dokumenteret på CoA'et, gælder for målingstidspunktet, oftest direkte efter syntese og oprensning. Forskningspeptider leveres derfor næsten altid som lyofilisat, altså som frysetørret pulver, fordi fjernelsen af vand stærkt forsinker de hydrolytiske og oxidative nedbrydningsveje. Ifølge Lai & Topp, 1999 bestemmes den kemiske stabilitet i fast tilstand i væsentlig grad af temperatur, restfugt og aggregattilstand, og selv en lille restfugt kan fremskynde aggregeringen.
Det betyder i praksis: den flotteste 99%-angivelse nytter kun lidt, hvis materialet efterfølgende opbevares forkert. En kølig, tør og lysbeskyttet opbevaring af det forseglede lyofilisat bevarer længst den profil, der er dokumenteret på CoA'et. Bliver et peptid rekonstitueret, altså bragt i opløsning, begynder de vandafhængige nedbrydningsreaktioner at forløbe hurtigere, og det oprindelige kromatogram mister sin gyldighed. Den, der vil fortolke renhedsdata korrekt, må derfor holde målings- og anvendelsestidspunkt adskilt: CoA'et beskriver leveringstilstanden, ikke den vedvarende tilstand over hele brugsperioden.
En systematisk kontrol tager kun nogle få minutter og gør de abstrakte værdier håndgribelige. Gennemgå dokumentet i denne rækkefølge:
Mangler et af disse punkter, er CoA'et ufuldstændigt. Særligt kritisk er det, hvis originalgrafikkerne mangler: uden kromatogram og spektrum forbliver renhedstallet en ren påstand. Et fuldstændigt, batchbundet dokument med alle rådata er derimod det stærkeste kvalitetssignal, som et forskningspeptid kan medbringe. Det giver dig mulighed for selv at efterprøve udsagnene i stedet for at forlade dig på et isoleret tal.
HPLC-renheden er en relativ arealangivelse og fortæller, hvor stor en andel af de UV-aktive bestanddele der tilfalder målpeptidet. Peptidindholdet angiver derimod, hvor meget rent peptid der er indeholdt pr. milligram samlet pulver, og tager også højde for UV-inaktive bestanddele som salte og restvand. Begge værdier supplerer hinanden og bør betragtes hver for sig.
Ikke automatisk, da tallet er metodeafhængigt. Et dokumenteret kromatogram ved 98% kan være mere udsigelseskraftigt end en nøgen 99%-angivelse uden originaldata. Det afgørende er, at renheden er dokumenteret med et efterprøveligt, batchrelateret kromatogram, og at målemetoden er klart angivet.
HPLC adskiller kun efter fysisk-kemiske egenskaber og viser separationsadfærden, ikke den molekylære sammensætning. To forskellige molekyler kunne teoretisk eluere på lignende måde. Først massespektrometrien måler molekylvægten og bekræfter ved sammenligning med den teoretiske værdi, at det faktisk er målpeptidet, der er til stede.
Et CoA dokumenterer tilstanden på analysetidspunktet, oftest direkte efter syntese. Det forbliver gyldigt som oprindelsesbevis, men beskriver ikke tilstanden efter lang eller forkert opbevaring. Vær opmærksom på en angivet analysedato, og tag højde for, at den reelle renhed afhænger af opbevaringsbetingelserne.
Kun til forskningsformål. Ikke beregnet til konsum for mennesker. Videnskabelig redaktion: Dr. Sieglinde Klaus
