KPV (Lys-Pro-Val): tutkimusopas alpha-MSH:n tulehdusta hillitsevästä tripeptidistä

KPV on alpha-melanosyyttejä stimuloivan hormonin (alpha-MSH) C-terminaalinen tripeptidi (jäännökset 11-13, Lys-Pro-Val). Sen tutkimuksessa määräävä ominaisuus on voimakas tulehdusta hillitsevä aktiivisuus, joka tapahtuu suurelta osin reseptorista riippumatta ja solunsisäisesti: peptidi otetaan di-/tripeptidikuljettaja PepT1:n kautta epiteeli- ja immuunisoluihin ja estää siellä transkriptiotekijä NF-kB:n siirtymisen tumaan (Dalmasso et al., 2008).

Mikä KPV on ja mistä tripeptidi on peräisin?

KPV (yksikirjaiminen koodi K-P-V) on lyhyt, lineaarinen tripeptidi, joka koostuu kolmesta aminohaposta: lysiinistä, proliinista ja valiinista. Se vastaa alpha-melanosyyttejä stimuloivan hormonin (alpha-MSH), erään melanokortiinin, C-terminaalin jäännöksiä 11-13. Näin KPV kuuluu melanokortiinista johdettujen peptidifragmenttien luokkaan. Summakaava on C16H30N4O4 ja molaarimassa noin 342,44 g/mol vapaalle hapolle. Monet tutkimuskäyttöiset valmisteet ovat kuitenkin N-asetyloidussa ja amidoidussa muodossa (Ac-KPV-NH2), jonka massa poikkeaa hieman.

On huomionarvoista, että KPV kantaa alpha-MSH:n vaikutuksen tulehdusta hillitsevää osaa laukaisematta täydellisen hormonin pigmentoivia vaikutuksia. Toisin kuin alpha-MSH tai melanotaanin kaltaiset MC1R-agonistit, tripeptidi ei aktivoi cAMP-välitteistä MC1R-vastetta melanosyyteissä, joten pigmentaatiota ei käynnistetä (Land, 2012). Oma erillinen muunnoksensa on D-proliinianalogi Lys-D-Pro-Val (KdPV), joka on proteaasivakaa ja jota käytetään joissakin tutkimuksissa (Haddad et al., 2001). Tutkimuskäytännössä KPV:tä käytetään ennen kaikkea mallipeptidinä tulehdussignaalireittien solunsisäiseen säätelyyn.

Miten KPV vaikuttaa molekyylitasolla?

KPV:n hallitseva mekanismi on solunsisäinen ja suurelta osin reseptorista riippumaton. Tripeptidi otetaan ihmisen peptidikuljettaja PepT1:n (hPepT1) kautta epiteeli- ja immuunisoluihin. Affiniteetti vaihtelee solutyypin mukaan: suoliston epiteelisoluissa Km-arvo on noin 160 uM, Jurkat-immuunisoluissa noin 700 uM (Dalmasso et al., 2008). Soluun pääsyn jälkeen KPV rikastuu solun tumaan ja estää siellä kilpailevasti NF-kB:n alayksikön p65/RelA ja importiini-alpha3:n välisen vuorovaikutuksen (armadillo-domeeneissa 7-8). Tämä estää NF-kB-dimeerin siirtymisen tumaan (Land, 2012).

Lisäksi KPV vakauttaa inhibiittori IkB-alphaa kumoamalla sen fosforylaation ja hajoamisen, ja se estää MAPK-signaloinnin (Dalmasso et al., 2008; Haddad et al., 2001). Nettovaikutuksena nanomolaariset jopa mikromolaariset pitoisuudet vaimentavat tulehdusta edistäviä sytokiineja kuten IL-6, IL-8, IL-12, IFN-gamma, IL-1beta sekä TNF-alphan ohjaamaa NF-kB-reportteriaktiivisuutta laskematta tulehdusta hillitsevää IL-10:tä. Sekundaarinen, osittain reseptorivälitteinen komponentti MC3R/MC1R:n kautta on kuvattu hengitysteiden ja muissa epiteeleissä (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021).

Mitä antimikrobista aktiivisuutta tutkimuksissa on dokumentoitu?

Riippumatta kuvatuista signaalivaikutuksista alpha-MSH:n C-terminaalisella sekvenssillä, johon KPV kuuluu, on suoraa antimikrobista ja sienenvastaista aktiivisuutta. Tutkimuksissa tämä vaikutus havaittiin bakteeri Staphylococcus aureusta sekä hiivasieni Candida albicansia vastaan (Cutuli et al., 2000). Tämä ominaisuus on mekanistisesti erillinen NF-kB:n säätelystä ja perustuu peptidin suoraan vuorovaikutukseen mikro-organismien kanssa.

Laajemmassa tarkastelussa alpha-MSH:ta ja siitä johdettuja fragmentteja käsitellään tulehdusta ja mikrobeja hillitsevien peptidien nousevana luokkana, joka yhdistää kaksoisroolin immunomodulaatiosta ja suorasta taudinaiheuttajien estosta (Singh und Mukhopadhyay, 2014). Tämä yhdistelmä tekee tripeptidistä perustutkimukselle kiinnostavan, koska se yhdistää kaksi muutoin erillistä vaikutusperiaatetta hyvin pieneen molekyyliin. Tärkeää on pitää tämä mielessä: kaikki nämä löydökset ovat peräisin in vitro- ja mallijärjestelmistä. Hallittuja ihmistietoja, jotka tukisivat antimikrobista käyttöä ihmisellä, ei ole. Tutkimukset viittaavat ainoastaan mekanistiseen potentiaaliin, jota on havaittu prekliinisissä järjestelmissä ja joka on jatkotutkimusten kohteena.

Mitä annoksia tutkimuksessa käytetään?

KPV:lle ei ole vakiintuneita terapeuttisia ihmisannoksia; peptidi ei ole FDA:n hyväksymä. Kaikki raportoidut tutkimustiedot ovat peräisin in vitro- ja eläinmalleista. Soluviljelytutkimuksissa tulehdusta hillitseviä vaikutuksia ilmeni laajalla pitoisuusalueella noin 10 nM:stä 100 uM:iin. Hengitysteiden epiteeliä koskevissa tutkimuksissa käytettiin pitoisuuksia 0,1-10 ug/mL, jolloin havaittiin annosriippuvainen vaimentuminen vähintään 1 ug/mL:n arvoista alkaen (Land, 2012).

Hiiren koliittimallissa KPV:tä annettiin juomaveden mukana pitoisuudella 100 uM. Tällöin DSS- ja TNBS-indusoitu tulehdus väheni, ja myeloperoksidaasiaktiivisuus tulehdusmerkkiaineena laski noin 50 prosenttia (Dalmasso et al., 2008). Tämä paikallinen teho suolistossa selittyy suoraan kudoksessa tapahtuvalla PepT1-välitteisellä solunsisäisellä otolla eikä jatkuvilla systeemisillä pitoisuuksilla.

Internetissä liikkuu toimittajien ja klinikoiden protokollia, esimerkiksi 200-500 mcg päivässä ihonalaisesti tai oraalisia 10 mg:n pulloja. Nämä tiedot eivät perustu julkaistuihin ihmisen PK- tai tehotietoihin, ja niitä tulee pitää anekdoottisina ja validoimattomina. Jos haluat laskea teoreettisia pitoisuuksia, voit tarkastella KPV:tä laske KPV peptidilaskurissa.

Miten KPV:n puoliintumisaikaa ja farmakokinetiikkaa tulee arvioida?

Rehellinen tarkastelu on tässä ratkaisevaa: KPV:llä ei ole vertaisarvioidussa tieteellisessä kirjallisuudessa validoitua systeemistä puoliintumisaikaa ihmisellä. Plasman puoliintumisaika, puhdistuma, oraalinen biologinen hyötyosuus ja kudosjakauma ovat ihmisen yhteydessä käytännössä luonnehtimatta. Suojaamattomana pienenä peptidinä KPV hydrolysoituu nopeasti peptidaasien vaikutuksesta. Eräs tutkimus osoitti, että asetyloitu KPV hajosi entsyymi pronaasin vaikutuksesta 24 tunnin sisällä täysin kolmeksi aminohapokseen, mikä sai tekijät kehittämään glykoalkyloivan modifikaation vakauden parantamiseksi (Songok et al., 2018).

Usein lainatut tiedot noin 30 minuutin tai noin 0,5 tunnin plasman puoliintumisajasta eivät ole jäljitettävissä alkuperäiseen ihmisen PK-tutkimukseen. Ne näyttävät olevan peräisin sekundaarisilta toimittajien sivustoilta, ja niitä tulee käsitellä nimenomaisesti varmistamattomina arvioina eikä kirjallisuuteen perustuvina arvoina. Tämänkokoiset peptidivaikuttajat kärsivät yleisesti proteolyyttisestä epävakaudesta ja lyhyestä puoliintumisajasta. Ymmärtämisen kannalta ratkaisevaa on, että KPV:n paikallinen teho, esimerkiksi suolistossa, selittyy PepT1-välitteisellä solunsisäisellä otolla kudoksessa eikä jatkuvilla systeemisillä pitoisuuksilla (Dalmasso et al., 2008). Julkaistujen arvojen kanssa työskentelevän tulisi dokumentoida tämä epävarmuus läpinäkyvästi.

Miten KPV liuotetaan ja säilytetään?

KPV:lle ei ole vertaisarvioitua säilytys- tai lämpötilaprotokollaa. Seuraavat ohjeet ovat peräisin yleisistä lyofilisoitujen peptidien käsittelysuosituksista eivätkä alkuperäisestä kirjallisuudesta. Niitä on siten pidettävä varotoimenpiteinä eikä validoituina määräyksinä. Lyofilisoitu jauhe säilytetään pitkäaikaista säilytystä varten tyypillisesti miinus 20 celsiusasteessa tai kylmemmässä. Tämä suositus noudattaa yleistä tapaa käsitellä pieniä peptidejä, joiden tunnettu alttius peptidaaseille puoltaa hajoamiselta suojaamista.

Liuottamisen jälkeen bakteriostaattisella tai steriilillä vedellä liuos tulisi pitää jäähdytettynä 2-8 celsiusasteessa ja käyttää muutaman viikon kuluessa. Toistuvia jäädytys-sulatussyklejä on vältettävä, samoin pitkäaikaista altistumista huoneenlämmölle, koska tripeptidin proteolyyttinen epävakaus on dokumentoitu (Songok et al., 2018). Liuosta valmistettaessa on suositeltavaa antaa liuottimen valua hitaasti astian seinämää pitkin sen sijaan, että suihku suunnattaisiin suoraan jauheeseen, jotta mekaaninen rasitus minimoidaan. Lähtömateriaalin puhtaus, joka ilmoitetaan tavallisesti 98 prosentin tai korkeampina arvoina, tulisi dokumentoida analyysitodistuksella, koska sääntelemättömät tutkimustoimittajat voivat vaihdella suuresti laadun ja epäpuhtausprofiilin osalta. Jokaisen erän huolellinen dokumentointi on välttämätöntä toistettavien tutkimustulosten kannalta.

Mitä haittavaikutuksia tutkimuksista tunnetaan?

KPV:lle ei ole hallittuja ihmisen turvallisuustietoja. Katsausartikkeleissa alpha-MSH-analogeja kuvataan yleisesti aineina, joilla on edullinen turvallisuusprofiili, mutta KPV:n erityistä toksikologiaa ei esitetä yksityiskohtaisesti (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021). Tärkeä erottava piirre on, että KPV ei toisin kuin täydellinen alpha-MSH ja toisin kuin melanotaanin kaltaiset MC1R-agonistit laukaise pigmentaatiota. Näin yksi melanokortiinipohjaisten peptidien usein käsitellyistä ominaisuuksista jää pois.

Järkeviä teoreettisia ja anekdoottisia huolenaiheita ovat reaktiot pistoskohdassa, mahdollinen immunogeenisuus sekä tuotteen puhtauteen ja epäpuhtauksiin liittyvä riski sääntelemättömistä tutkimuslähteistä. Koska KPV vaimentaa transkriptiotekijä NF-kB:tä ja hillitsee synnynnäisiä sytokiinivasteita, laajat tai krooniset immunosuppressiiviset vaikutukset ovat uskottava mutta toistaiseksi tutkimaton näkökohta. Tutkimukset viittaavat siihen, että vaikutus kohdistuu valikoivasti tulehdusta edistäviin signaalireitteihin, mutta pitkäaikaisdata synnynnäisen immuunivasteen pysyvän vaimentamisen mahdollisista seurauksista puuttuu kokonaan. KPV on tarkoitettu yksinomaan tutkimuskäyttöön eikä terapeuttiseen käyttöön ihmisellä. Kaiken peptidillä tehtävän työn tulisi tapahtua laboratorio-olosuhteissa ja dokumentoiduilla turvatoimilla.

Miten KPV eroaa BPC-157:stä, Selankista ja Thymosin Alpha-1:stä?

KPV erottuu alkuperänsä, kokonsa ja vaikutusmekanisminsa osalta selvästi muista tutkimuspeptideistä. BPC-157:ään verrattuna ero on perustavanlaatuinen: BPC-157 on synteettinen fragmentti, joka koostuu 15 aminohaposta ihmisen mahalaukun body protection compoundista, ja se yhdistetään tutkimuksessa angiogeneesiin VEGFR2-eNOS-signaalireitin kautta sekä kudoksen, jänteiden ja suoliston uusiutumiseen. KPV taas on kolmesta aminohaposta koostuva tripeptidi, jonka tunnusmerkki on PepT1-riippuvainen solunsisäinen NF-kB:n esto. Lähtörakenne, koko, kuljetusreitti ja ensisijainen mekanismi eroavat täysin toisistaan (Dalmasso et al., 2008; Land, 2012).

Selank on immunomoduloivan peptidin tuftsiinin synteettinen heptapeptidianalogi, joka on kehitetty ahdistusta lievittäväksi ja nootrooppiseksi aineeksi GABAergisten, monoaminergisten ja BDNF-signaalireittien kautta keskushermostossa. KPV ei ole neuroaktiivinen ja vaikuttaa perifeeriseen ja epiteeliseen NF-kB-tulehdukseen; alkuperä ja kohdejärjestelmä ovat toisiinsa liittymättömät. Thymosin Alpha-1 puolestaan on 28 aminohaposta koostuva kateenkorvaperäinen peptidi, joka vaikuttaa laajasti immuunijärjestelmää stimuloivasti edistämällä T-solujen kypsymistä sekä TLR- ja dendriittisolusignalointia. KPV on immunosuppressiivisella, tulehdusta hillitsevällä suuntauksellaan immunomodulatorisen spektrin vastakkaisessa päässä ja eroaa kooltaan ja lähteeltään täysin.

Miksi KPV ei laukaise pigmentaatiota?

Tämä kysymys on keskeinen KPV:n selektiivisyyden ymmärtämiseksi. Täydellinen alpha-MSH aktivoi melanokortiini-1-reseptorin (MC1R) melanosyyteissä ja käynnistää sitä kautta cAMP-välitteisen vasteen, joka johtaa melaniinin muodostumiseen ja siten pigmentaatioon. Juuri tätä akselia melanotaanin kaltaiset MC1R-agonistit hyödyntävät. KPV C-terminaalisena tripeptidinä kantaa kuitenkin hormonin tulehdusta hillitsevää aktiivisuutta laukaisematta pigmentoivaa MC1R-cAMP-vastetta melanosyyteissä (Land, 2012).

Syy on tripeptidin hallitsevassa reseptorista riippumattomassa vaikutustavassa. Kun pigmentaatio edellyttää täydellistä, klassista reseptorin aktivaatiota, KPV:n tulehdusta hillitsevä vaikutus perustuu pääosin NF-kB:n tumaan siirtymisen solunsisäiseen estoon PepT1-oton jälkeen. Sekundaarinen, osittain reseptorivälitteinen komponentti MC3R:n ja MC1R:n kautta on tosin kuvattu hengitysteiden ja muissa epiteeleissä, mutta se ei riitä käynnistämään pigmentoivaa cAMP-kaskadia melanosyyteissä (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021). Tutkimuksen kannalta tämä erottelu tarkoittaa, että alpha-MSH-järjestelmän tulehdusta hillitseviä ominaisuuksia voidaan tutkia tuomatta mukaan sekoittavaa pigmentoivaa vaikutusta. Tämä selektiivisyys on yksi syy siihen, miksi KPV on saanut merkitystä mallipeptidinä melanokortiinivälitteisen tulehduksen säätelyn tutkimukseen.

Mikä merkitys PepT1:llä on kudosselektiivisyydelle?

Kuljettaja PepT1 on avain sen ymmärtämiseen, miksi KPV voi olla paikallisesti tehokas systeemisen vakauden puutteesta huolimatta. PepT1 on di- ja tripeptidikuljettaja, jota ilmennetään suoliston epiteelisoluissa ja immuunisoluissa. Sen kautta KPV pääsee solun sisään, missä se kehittää tulehdusta hillitsevän vaikutuksensa. Affiniteetti on kudosriippuvainen: suoliston epiteelisoluissa Km-arvo on noin 160 uM, Jurkat-immuunisoluissa noin 700 uM (Dalmasso et al., 2008).

Tämä kuljettajaan sidottu otto selittää näennäisen paradoksin nopean proteolyyttisen epävakauden ja dokumentoidun paikallisen tehon välillä. Hiiren koliittimallissa tulehdus väheni peptidin tunnetusta peptidaasialttiudesta huolimatta, koska PepT1 kuljettaa tripeptidin suoraan sairastuneessa suolistokudoksessa soluihin ennen kuin systeemistä kuljetusta ylipäätään tarvitaan. Teho on siten paikallisen solunsisäisen oton eikä systeemisen altistuksen kysymys. Tutkimukselle tästä seuraa selkeä mekanistinen kuva: kudokset, joissa PepT1:n ilmentyminen on korkea, erityisesti suoliston epiteeli, ovat uskottavimpia mallijärjestelmiä KPV:n tutkimukseen. Tutkimukset viittaavat siihen, että NF-kB:n esto vaikuttaa tehokkaimmin siellä, missä kuljettaja mahdollistaa peptidin solunsisäisen rikastumisen.

Usein kysytyt kysymykset KPV:stä

Onko KPV hyväksytty käytettäväksi ihmisellä?

Ei. KPV ei ole FDA:n tai vastaavan viranomaisen hyväksymä, eikä sillä ole vakiintuneita terapeuttisia ihmisannoksia. Kaikki saatavilla olevat tiedot ovat peräisin in vitro- ja eläinmalleista, ja peptidi on tarkoitettu yksinomaan tutkimuskäyttöön (Dalmasso et al., 2008).

Onko KPV:llä tunnettu puoliintumisaika?

Validoitua systeemistä puoliintumisaikaa ihmisellä ei ole tieteellisessä kirjallisuudessa. Usein mainitut noin 30 minuutin arvot eivät ole jäljitettävissä alkuperäiseen ihmisen PK-tutkimukseen, ja niitä pidetään varmistamattomina arvioina. Suojaamattomana tripeptidinä KPV hajoaa nopeasti peptidaasien vaikutuksesta (Songok et al., 2018).

Aiheuttaako KPV ihon ruskettumista?

Ei. Toisin kuin täydellinen alpha-MSH tai melanotaanin kaltaiset MC1R-agonistit, KPV ei laukaise pigmentoivaa MC1R-cAMP-vastetta melanosyyteissä ja kantaa siten tulehdusta hillitsevää aktiivisuutta ilman pigmentoivia vaikutuksia (Land, 2012).

Miten KPV tulisi säilyttää liuottamisen jälkeen?

Yleisestä peptidien käsittelystä johtuvan varovaisuussuosituksen mukaan liuotettu liuos pidetään jäähdytettynä 2-8 celsiusasteessa ja käytetään muutaman viikon kuluessa. Toistuvia jäädytys-sulatussyklejä ja pitkäaikaista huoneenlämpöä on vältettävä dokumentoidun proteolyyttisen epävakauden vuoksi (Songok et al., 2018).

Miten KPV eroaa Thymosin Alpha-1:stä?

KPV vaikuttaa tulehdusta hillitsevästi ja immunosuppressiivisesti vaimentamalla NF-kB:tä ja tulehdusta edistäviä sytokiineja. Thymosin Alpha-1 on sen sijaan huomattavasti suurempi peptidi, joka koostuu 28 aminohaposta ja vaikuttaa immuunijärjestelmää stimuloivasti. Molemmat ovat immunomodulatorisen spektrin vastakkaisissa päissä (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021).

Vain tutkimuskäyttöön. Ei tarkoitettu ihmisravinnoksi. Tieteellinen toimitus: Dr. Sieglinde Klaus