KPV (Lys-Pro-Val): przewodnik badawczy po przeciwzapalnym tripeptydzie alpha-MSH
Dr. Sieglinde Klaus
Redakcja naukowa · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Redakcja naukowa · Bergdorf Bioscience
KPV to C-koncowy tripeptyd (reszty 11-13, Lys-Pro-Val) hormonu stymulujacego melanocyty alfa (alpha-MSH). Jego definiujaca wlasciwoscia w badaniach jest wyrazna aktywnosc przeciwzapalna, ktora przebiega w duzej mierze niezaleznie od receptorow i wewnatrzkomorkowo: peptyd jest wchlaniany przez transporter di-/tripeptydowy PepT1 do komorek nablonkowych i odpornosciowych, gdzie blokuje translokacje jadrowa czynnika transkrypcyjnego NF-kB (Dalmasso et al., 2008).
KPV (kod jednoliterowy K-P-V) to krotki, liniowy tripeptyd zlozony z trzech aminokwasow: lizyny, proliny i waliny. Odpowiada resztom od 11 do 13 na C-koncu hormonu stymulujacego melanocyty alfa (alpha-MSH), nalezacego do melanokortyn. Tym samym KPV nalezy do klasy fragmentow peptydowych pochodzacych od melanokortyn. Wzor sumaryczny to C16H30N4O4 przy masie molowej okolo 342,44 g/mol dla wolnego kwasu. Wiele preparatow stosowanych w badaniach wystepuje jednak w formie N-acetylowanej i amidowanej (Ac-KPV-NH2), ktora nieznacznie rozni sie masa.
Godne uwagi jest to, ze KPV przenosi przeciwzapalna czesc dzialania alpha-MSH, nie wywolujac efektow pigmentujacych pelnego hormonu. W przeciwienstwie do alpha-MSH czy agonistow MC1R typu Melanotan tripeptyd nie aktywuje w melanocytach odpowiedzi MC1R posredniczonej przez cAMP, dzieki czemu nie dochodzi do pigmentacji (Land, 2012). Odrebnym wariantem jest analog z D-prolina Lys-D-Pro-Val (KdPV), ktory jest stabilizowany wobec proteaz i bywa wykorzystywany w niektorych badaniach (Haddad et al., 2001). W praktyce badawczej KPV jest stosowany przede wszystkim jako peptyd modelowy do wewnatrzkomorkowej modulacji szlakow sygnalowych zapalenia.
Dominujacy mechanizm dzialania KPV jest wewnatrzkomorkowy i w duzej mierze niezalezny od receptorow. Tripeptyd jest wchlaniany przez ludzki transporter peptydowy PepT1 (hPepT1) do komorek nablonkowych i odpornosciowych. Powinowactwo rozni sie w zaleznosci od typu komorek: w jelitowych komorkach nablonkowych wartosc Km wynosi okolo 160 uM, a w komorkach odpornosciowych Jurkat okolo 700 uM (Dalmasso et al., 2008). Po wchlonieciu KPV gromadzi sie w jadrze komorkowym, gdzie kompetycyjnie blokuje interakcje miedzy podjednostka NF-kB p65/RelA a importyna-alfa3 (w domenach armadillo 7 do 8). Uniemozliwia to translokacje jadrowa dimeru NF-kB (Land, 2012).
Dodatkowo KPV stabilizuje inhibitor IkB-alfa, odwracajac jego fosforylacje i degradacje, oraz hamuje sygnalizacje MAPK (Dalmasso et al., 2008; Haddad et al., 2001). W efekcie netto stezenia od nanomolarnych do mikromolarnych tlumia cytokiny prozapalne, takie jak IL-6, IL-8, IL-12, IFN-gamma, IL-1beta, a takze aktywnosc reportera NF-kB napedzana przez TNF-alpha, nie obnizajac przy tym przeciwzapalnej IL-10. Wtorny, czesciowo posredniczony przez receptory komponent dzialajacy przez MC3R/MC1R opisano w nablonku drog oddechowych i innych nablonkach (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021).
Niezaleznie od opisanych efektow sygnalowych C-koncowa sekwencja alpha-MSH, do ktorej nalezy KPV, wykazuje bezposrednia aktywnosc przeciwdrobnoustrojowa i przeciwgrzybicza. W badaniach to dzialanie ujawnilo sie wobec bakterii Staphylococcus aureus oraz wobec drozdzaka Candida albicans (Cutuli et al., 2000). Wlasciwosc ta jest mechanistycznie oddzielona od modulacji NF-kB i opiera sie na bezposredniej interakcji peptydu z mikroorganizmami.
W szerszym ujeciu alpha-MSH i jego pochodne fragmenty sa omawiane jako wylaniajaca sie klasa peptydow przeciwzapalnych i przeciwdrobnoustrojowych, ktore lacza podwojna funkcje immunomodulacji i bezposredniego hamowania patogenow (Singh und Mukhopadhyay, 2014). To polaczenie czyni tripeptyd interesujacym dla badan podstawowych, poniewaz laczy ono dwie zwykle odrebne zasady dzialania w bardzo malej czasteczce. Wazne pozostaje zastrzezenie: wszystkie te wyniki pochodza z ukladow in vitro i modelowych. Nie istnieja kontrolowane dane u ludzi, ktore wspieralyby zastosowanie przeciwdrobnoustrojowe u czlowieka. Badania wskazuja jedynie na potencjal mechanistyczny, ktory zaobserwowano w ukladach przedklinicznych i ktory jest przedmiotem dalszych badan.
Dla KPV nie istnieja ustalone terapeutyczne dawki dla ludzi; peptyd nie jest dopuszczony przez FDA. Wszystkie raportowane dane badawcze pochodza z modeli in vitro i zwierzecych. W badaniach hodowli komorkowych efekty przeciwzapalne pojawialy sie w szerokim zakresie stezen od okolo 10 nM do 100 uM. W badaniach na nablonku drog oddechowych stosowano stezenia od 0,1 do 10 ug/mL, przy czym zaleznie od dawki tlumienie obserwowano od wartosci co najmniej 1 ug/mL (Land, 2012).
W zwierzecym modelu zapalenia jelita grubego u myszy KPV podawano w stezeniu 100 uM przez wode pitna. Zmniejszylo to zapalenie wywolane DSS i TNBS, a aktywnosc mieloperoksydazy jako markera zapalenia spadla o okolo 50 procent (Dalmasso et al., 2008). Te miejscowa skutecznosc w jelicie tlumaczy posredniczone przez PepT1 wchlanianie komorkowe bezposrednio w tkance, a nie utrzymujace sie poziomy ogolnoustrojowe.
W internecie kraza protokoly dostawcow i klinik, na przyklad 200 do 500 mcg dziennie podskornie lub doustne fiolki 10 mg. Dane te nie sa poparte opublikowanymi danymi PK ani danymi o skutecznosci u ludzi i nalezy je traktowac jako anegdotyczne i niezwalidowane. Kto chce obliczyc teoretyczne stezenia, moze przesledzic KPV w obliczyc KPV w kalkulatorze peptydow.
Uczciwa ocena jest tu kluczowa: w recenzowanej literaturze fachowej KPV nie ma zwalidowanego ogolnoustrojowego okresu polowicznego rozpadu u czlowieka. Okres polowicznego rozpadu w osoczu, klirens, biodostepnosc doustna i dystrybucja tkankowa sa w kontekscie ludzkim praktycznie nieokreslone. Jako niezabezpieczony maly peptyd KPV jest szybko hydrolizowany przez peptydazy. Jedno z badan wykazalo, ze acetylowany KPV w ciagu 24 godzin zostal calkowicie rozlozony przez enzym pronaze do swoich trzech aminokwasow, co sklonilo autorow do modyfikacji glikoalkilujacej w celu poprawy stabilnosci (Songok et al., 2018).
Czesto cytowane dane o okolo 30 minutach lub okolo 0,5 godziny okresu polowicznego rozpadu w osoczu nie daja sie przypisac zadnemu pierwotnemu ludzkiemu badaniu PK. Wydaja sie one pochodzic z wtornych stron dostawcow i powinny byc wyraznie traktowane jako niezweryfikowane wartosci szacunkowe, a nie jako wartosci poparte literatura. Substancje peptydowe tej wielkosci cierpia ogolnie na niestabilnosc proteolityczna i krotki okres polowicznego rozpadu. Kluczowe dla zrozumienia jest to, ze miejscowa skutecznosc KPV, na przyklad w jelicie, tlumaczy sie posredniczonym przez PepT1 wchlanianiem komorkowym w tkance, a nie utrzymujacymi sie stezeniami ogolnoustrojowymi (Dalmasso et al., 2008). Kto pracuje z opublikowanymi wartosciami, powinien przejrzyscie dokumentowac te niepewnosc.
Dla KPV nie istnieje recenzowany protokol przechowywania ani temperatury. Ponizsze wskazowki pochodza z ogolnych zalecen dotyczacych obchodzenia sie z liofilizowanymi peptydami, a nie z literatury pierwotnej. Nalezy je odpowiednio rozumiec jako srodki ostroznosci, a nie jako zwalidowane przepisy. Liofilizowany proszek do dlugotrwalego przechowywania trzyma sie zwykle w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub nizszej. Zalecenie to wynika z ogolnego postepowania z malymi peptydami, ktorych znana podatnosc na peptydazy sugeruje ochrone przed rozkladem.
Po rekonstytucji woda bakteriostatyczna lub jalowa roztwor nalezy przechowywac schlodzony w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza i zuzyc w ciagu kilku tygodni. Nalezy unikac wielokrotnych cykli zamrazania i rozmrazania, a takze dluzszej ekspozycji w temperaturze pokojowej, poniewaz niestabilnosc proteolityczna tripeptydu jest udokumentowana (Songok et al., 2018). Przy sporzadzaniu roztworu zaleca sie powolne splywanie rozpuszczalnika po sciance naczynia, zamiast kierowania strumienia bezposrednio na proszek, aby zminimalizowac stres mechaniczny. Czystosc materialu wyjsciowego, zwykle podawana na poziomie 98 procent lub wyzszym, powinna byc udokumentowana w certyfikacie analizy, poniewaz nieregulowani dostawcy badawczy moga znacznie roznic sie jakoscia i profilem zanieczyszczen. Staranna dokumentacja kazdej partii jest niezbedna dla powtarzalnych wynikow badan.
Dla KPV nie ma kontrolowanych danych o bezpieczenstwie u ludzi. W pracach przegladowych analogi alpha-MSH sa ogolnie opisywane jako substancje o korzystnym profilu bezpieczenstwa, jednak specyficzna toksykologia dla KPV nie jest szczegolowo przedstawiona (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021). Wazna cecha odrozniajaca jest to, ze KPV, w przeciwienstwie do pelnego alpha-MSH i w przeciwienstwie do agonistow MC1R typu Melanotan, nie wywoluje pigmentacji. Tym samym odpada jedna z czesto omawianych wlasciwosci peptydow opartych na melanokortynach.
Rozsadne teoretyczne i anegdotyczne obawy dotycza reakcji w miejscu wstrzykniecia, mozliwej immunogennosci oraz ryzyka wynikajacego z czystosci produktu i zanieczyszczen z nieregulowanych zrodel badawczych. Poniewaz KPV tlumi czynnik transkrypcyjny NF-kB i oslabia wrodzone odpowiedzi cytokinowe, szerokie lub przewlekle efekty immunosupresyjne sa prawdopodobnym, lecz dotychczas niezbadanym aspektem. Badania wskazuja, ze dzialanie selektywnie dotyczy prozapalnych szlakow sygnalowych, jednak calkowicie brakuje danych dlugoterminowych o mozliwych skutkach trwalego oslabienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. KPV jest przeznaczony wylacznie do celow badawczych i nie jest przewidziany do zastosowania terapeutycznego u czlowieka. Kazda praca z tym peptydem powinna odbywac sie w warunkach laboratoryjnych i z udokumentowanymi srodkami bezpieczenstwa.
KPV wyraznie odrozniaja od innych peptydow badawczych pochodzenie, wielkosc i mechanizm dzialania. Wobec BPC-157 roznica jest zasadnicza: BPC-157 to syntetyczny fragment 15 aminokwasow ludzkiego zoladkowego Body Protection Compound, ktory w badaniach laczy sie z angiogeneza przez szlak VEGFR2-eNOS oraz z regeneracja tkanek, sciegien i jelit. KPV jest natomiast tripeptydem z trzech aminokwasow, ktorego cecha wyrozniajaca jest zalezna od PepT1 wewnatrzkomorkowa blokada NF-kB. Struktura macierzysta, wielkosc, droga transportu i podstawowy mechanizm roznia sie calkowicie (Dalmasso et al., 2008; Land, 2012).
Selank to syntetyczny analog heptapeptydowy immunomodulacyjnego peptydu tuftsyny, opracowany jako substancja o dzialaniu przeciwlekowym i nootropowym poprzez szlaki GABA-ergiczne, monoaminergiczne i BDNF w osrodkowym ukladzie nerwowym. KPV nie jest neuroaktywny i dziala na obwodowe i nablonkowe zapalenie NF-kB; pochodzenie i uklad docelowy sa niespokrewnione. Thymosin Alpha-1 to wreszcie peptyd grasiczy z 28 aminokwasow, ktory dziala szeroko immunostymulujaco, wspierajac dojrzewanie limfocytow T oraz sygnalizacje TLR i komorek dendrytycznych. KPV ze swoim immunosupresyjnym, przeciwzapalnym ukierunkowaniem znajduje sie na przeciwnym koncu spektrum immunomodulacyjnego i rozni sie calkowicie wielkoscia i zrodlem.
To pytanie jest kluczowe dla zrozumienia selektywnosci KPV. Pelny alpha-MSH aktywuje receptor melanokortyny 1 (MC1R) na melanocytach i wyzwala przez to odpowiedz posredniczona przez cAMP, ktora prowadzi do tworzenia melaniny, a tym samym do pigmentacji. Dokladnie te os wykorzystuja agonisci MC1R typu Melanotan. KPV jako C-koncowy tripeptyd przenosi jednak przeciwzapalna aktywnosc hormonu, nie wyzwalajac pigmentacyjnej odpowiedzi MC1R-cAMP w melanocytach (Land, 2012).
Powodem jest dominujacy, niezalezny od receptorow sposob dzialania tripeptydu. Podczas gdy pigmentacja wymaga pelnej, klasycznej aktywacji receptora, przeciwzapalny efekt KPV opiera sie przewaznie na wewnatrzkomorkowej blokadzie translokacji jadrowej NF-kB po wchlonieciu przez PepT1. Wtorny, czesciowo posredniczony przez receptory komponent dzialajacy przez MC3R i MC1R jest wprawdzie opisany w nablonku drog oddechowych i innych nablonkach, lecz nie wystarcza, aby uruchomic pigmentacyjna kaskade cAMP w melanocytach (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021). Dla badan to rozdzielenie oznacza, ze przeciwzapalne wlasciwosci ukladu alpha-MSH mozna badac bez wprowadzania zaklocajacego efektu pigmentacyjnego. Ta selektywnosc jest jednym z powodow, dla ktorych KPV zyskal na znaczeniu jako peptyd modelowy do modulacji zapalenia posredniczonej przez melanokortyny.
Transporter PepT1 jest kluczem do zrozumienia, dlaczego KPV mimo braku stabilnosci ogolnoustrojowej moze byc skuteczny miejscowo. PepT1 to transporter di- i tripeptydow, ktory ulega ekspresji w jelitowych komorkach nablonkowych i w komorkach odpornosciowych. Przez niego KPV dostaje sie do wnetrza komorki, gdzie rozwija swoje przeciwzapalne dzialanie. Powinowactwo zalezy od tkanki: w jelitowych komorkach nablonkowych wartosc Km wynosi okolo 160 uM, a w komorkach odpornosciowych Jurkat okolo 700 uM (Dalmasso et al., 2008).
To zwiazane z transporterem wchlanianie tlumaczy pozorny paradoks miedzy szybka niestabilnoscia proteolityczna a udokumentowana skutecznoscia miejscowa. W mysim modelu zapalenia jelita grubego zapalenie zostalo zmniejszone mimo znanej podatnosci peptydu na peptydazy, poniewaz PepT1 wprowadza tripeptyd bezposrednio do komorek dotknietej tkanki jelitowej, zanim w ogole stanie sie konieczny transport ogolnoustrojowy. Skutecznosc jest zatem kwestia miejscowego wchlaniania komorkowego, a nie ekspozycji ogolnoustrojowej. Dla badan wynika z tego jasny obraz mechanistyczny: tkanki o wysokiej ekspresji PepT1, w szczegolnosci nablonek jelitowy, sa najbardziej prawdopodobnymi ukladami modelowymi do badania KPV. Badania wskazuja, ze blokada NF-kB dziala najskuteczniej tam, gdzie transporter umozliwia wewnatrzkomorkowe gromadzenie peptydu.
Nie. KPV nie jest dopuszczony przez FDA ani porownywalny organ i nie ma ustalonych terapeutycznych dawek dla ludzi. Wszystkie dostepne dane pochodza z modeli in vitro i zwierzecych, a peptyd jest przeznaczony wylacznie do celow badawczych (Dalmasso et al., 2008).
Zwalidowany ogolnoustrojowy okres polowicznego rozpadu u czlowieka nie istnieje w literaturze fachowej. Czesto podawane wartosci okolo 30 minut nie daja sie przypisac pierwotnemu ludzkiemu badaniu PK i uznaje sie je za niezweryfikowane wartosci szacunkowe. Jako niezabezpieczony tripeptyd KPV jest szybko rozkladany przez peptydazy (Songok et al., 2018).
Nie. W przeciwienstwie do pelnego alpha-MSH lub agonistow MC1R typu Melanotan KPV nie wyzwala pigmentacyjnej odpowiedzi MC1R-cAMP w melanocytach i tym samym przenosi przeciwzapalna aktywnosc bez efektow pigmentacyjnych (Land, 2012).
Zgodnie z zaleceniem ostroznosci wynikajacym z ogolnego obchodzenia sie z peptydami rekonstytuowany roztwor przechowuje sie schlodzony w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza i zuzywa w ciagu kilku tygodni. Nalezy unikac wielokrotnych cykli zamrazania i rozmrazania oraz dluzszej temperatury pokojowej ze wzgledu na udokumentowana niestabilnosc proteolityczna (Songok et al., 2018).
KPV dziala przeciwzapalnie i immunosupresyjnie, tlumiac NF-kB i cytokiny prozapalne. Thymosin Alpha-1 jest natomiast znacznie wiekszym peptydem z 28 aminokwasow i dziala immunostymulujaco. Oba znajduja sie na przeciwnych koncach spektrum immunomodulacyjnego (Dinparastisaleh und Mirsaeidi, 2021).
Wylacznie do celow badawczych. Nieprzeznaczone do spozycia przez ludzi. Redakcja naukowa: Dr. Sieglinde Klaus