KPV (Lys-Pro-Val): guia de investigacao sobre o tripeptido anti-inflamatorio derivado da alpha-MSH

O KPV e o tripeptido C-terminal (residuos 11-13, Lys-Pro-Val) da hormona estimuladora dos melanocitos alpha (alpha-MSH). A sua propriedade definidora na investigacao e uma marcada atividade anti-inflamatoria que ocorre em grande medida de forma independente de recetores e a nivel intracelular: o peptido e captado pelo transportador de di-/tripeptidos PepT1 nas celulas epiteliais e imunitarias e ai bloqueia a translocacao nuclear do fator de transcricao NF-kB (Dalmasso et al., 2008).

O que e o KPV e de onde provem o tripeptido?

O KPV (codigo de uma letra K-P-V) e um tripeptido curto e linear constituido pelos tres aminoacidos lisina, prolina e valina. Corresponde aos residuos 11 a 13 no C-terminal da hormona estimuladora dos melanocitos alpha (alpha-MSH), uma melanocortina. Assim, o KPV pertence a classe dos fragmentos peptidicos derivados das melanocortinas. A formula molecular e C16H30N4O4 com uma massa molar de cerca de 342,44 g/mol para o acido livre. No entanto, muitos preparados habituais em investigacao apresentam-se na forma N-acetilada e amidada (Ac-KPV-NH2), cuja massa difere ligeiramente.

E digno de nota que o KPV transporta a parte anti-inflamatoria da acao da alpha-MSH, sem desencadear os efeitos pigmentantes da hormona completa. Ao contrario da alpha-MSH ou dos agonistas do MC1R do tipo melanotan, o tripeptido nao ativa a resposta MC1R mediada por cAMP nos melanocitos, pelo que nao se inicia qualquer pigmentacao (Land, 2012). Uma variante autonoma e o analogo D-prolina Lys-D-Pro-Val (KdPV), que e estabilizado contra proteases e e utilizado em alguns estudos (Haddad et al., 2001). Na pratica de investigacao, o KPV e utilizado sobretudo como peptido modelo para a modulacao intracelular das vias de sinalizacao inflamatoria.

Como atua o KPV a nivel molecular?

O mecanismo dominante do KPV e intracelular e em grande medida independente de recetores. O tripeptido e captado pelo transportador humano de peptidos PepT1 (hPepT1) nas celulas epiteliais e imunitarias. A afinidade difere consoante o tipo de celula: nas celulas epiteliais intestinais o valor de Km situa-se em cerca de 160 uM, nas celulas imunitarias Jurkat em torno de 700 uM (Dalmasso et al., 2008). Apos a captacao, o KPV acumula-se no nucleo celular e ai bloqueia de forma competitiva a interacao entre a subunidade NF-kB p65/RelA e a importina-alpha3 (nos dominios armadillo 7 a 8). Desta forma e impedida a translocacao nuclear do dimero NF-kB (Land, 2012).

Adicionalmente, o KPV estabiliza o inibidor IkB-alpha, ao reverter a sua fosforilacao e degradacao, e inibe a sinalizacao MAPK (Dalmasso et al., 2008; Haddad et al., 2001). Como efeito liquido, concentracoes nanomolares a micromolares suprimem citocinas pro-inflamatorias como IL-6, IL-8, IL-12, IFN-gamma, IL-1beta, bem como a atividade do gene reporter NF-kB induzida por TNF-alpha, sem reduzir a citocina anti-inflamatoria IL-10. Uma componente secundaria, parcialmente mediada por recetores, atraves de MC3R/MC1R, e descrita nos epitelios das vias respiratorias e noutros epitelios (Dinparastisaleh e Mirsaeidi, 2021).

Que atividade antimicrobiana esta documentada em estudos?

Independentemente dos efeitos de sinalizacao descritos, a sequencia C-terminal da alpha-MSH, a qual o KPV pertence, possui uma atividade antimicrobiana e antifungica direta. Em estudos, este efeito manifestou-se contra a bacteria Staphylococcus aureus, bem como contra a levedura Candida albicans (Cutuli et al., 2000). Esta propriedade e, do ponto de vista mecanistico, separada da modulacao do NF-kB e baseia-se na interacao direta do peptido com os microorganismos.

Num enquadramento mais amplo, a alpha-MSH e os seus fragmentos derivados sao discutidos como uma classe emergente de peptidos anti-inflamatorios e antimicrobianos, que combinam uma dupla funcao de imunomodulacao e inibicao direta de agentes patogenicos (Singh e Mukhopadhyay, 2014). Esta combinacao torna o tripeptido interessante para a investigacao fundamental, pois reune dois principios de acao normalmente separados numa molecula muito pequena. Mantem-se importante o enquadramento: todos estes resultados provem de sistemas in vitro e de sistemas modelo. Nao existem dados humanos controlados que sustentem uma aplicacao antimicrobiana em humanos. Os estudos apenas apontam para um potencial mecanistico, observado em sistemas pre-clinicos e que e objeto de investigacoes adicionais.

Que dosagens sao utilizadas na investigacao?

Para o KPV nao existem doses humanas terapeuticas estabelecidas; o peptido nao esta aprovado pela FDA. Todas as indicacoes de investigacao reportadas provem de modelos in vitro e animais. Em estudos de cultura celular, observaram-se efeitos anti-inflamatorios ao longo de um amplo intervalo de concentracoes, de cerca de 10 nM a 100 uM. Em estudos em epitelio das vias respiratorias foram utilizadas concentracoes de 0,1 a 10 ug/mL, tendo-se observado uma supressao dependente da dose a partir de valores de pelo menos 1 ug/mL (Land, 2012).

No modelo animal de colite em ratinho, o KPV foi administrado numa concentracao de 100 uM atraves da agua de beber. Com isto, reduziu-se a inflamacao induzida por DSS e TNBS, e a atividade da mieloperoxidase, como marcador de inflamacao, diminuiu cerca de 50 por cento (Dalmasso et al., 2008). Esta eficacia local no intestino e explicada pela captacao celular mediada por PepT1 diretamente no tecido, e nao por niveis sistemicos persistentes.

Na Internet circulam protocolos de fornecedores e de clinicas, por exemplo 200 a 500 mcg por dia por via subcutanea ou frascos orais de 10 mg. Estas indicacoes nao sao sustentadas por dados humanos publicados de PK ou de eficacia e devem ser consideradas anedoticas e nao validadas. Quem pretender calcular concentracoes teoricas pode acompanhar o KPV no calcular o KPV no calculador de peptidos.

Como avaliar a semivida e a farmacocinetica do KPV?

Um enquadramento honesto e aqui decisivo: o KPV nao possui, na literatura cientifica revista por pares, uma semivida sistemica validada em humanos. Semivida plasmatica, depuracao, biodisponibilidade oral e distribuicao tecidual praticamente nao estao caracterizadas no contexto humano. Como pequeno peptido nao protegido, o KPV e rapidamente hidrolisado por peptidases. Um estudo demonstrou que o KPV acetilado foi totalmente degradado nos seus tres aminoacidos pela enzima pronase no prazo de 24 horas, o que motivou os autores a uma modificacao glicoalquilante para melhorar a estabilidade (Songok et al., 2018).

As indicacoes frequentemente citadas de cerca de 30 minutos ou de aproximadamente 0,5 horas de semivida plasmatica nao podem ser atribuidas a um estudo primario humano de PK. Parecem provir de paginas secundarias de fornecedores e devem ser tratadas expressamente como valores estimados nao verificados e nao como valores sustentados pela literatura. Os agentes peptidicos deste tamanho sofrem genericamente de instabilidade proteolitica e de semivida curta. Decisivo para a compreensao e que a eficacia local do KPV, por exemplo no intestino, e explicada pela captacao celular mediada por PepT1 no tecido e nao por concentracoes sistemicas persistentes (Dalmasso et al., 2008). Quem trabalhar com valores publicados deve documentar essa incerteza de forma transparente.

Como se reconstitui e armazena o KPV?

Para o KPV nao existe qualquer protocolo de armazenamento ou de temperatura revisto por pares. As indicacoes seguintes provem de recomendacoes gerais de manuseamento de peptidos liofilizados e nao da literatura primaria. Devem, por isso, ser entendidas como medidas de precaucao e nao como prescricoes validadas. O po liofilizado e tipicamente conservado a menos 20 graus Celsius ou mais frio para armazenamento de longa duracao. Esta recomendacao segue o manuseamento geral de pequenos peptidos, cuja conhecida suscetibilidade as peptidases sugere uma protecao contra a degradacao.

Apos a reconstituicao com agua bacteriostatica ou esteril, a solucao deve ser mantida refrigerada a 2 a 8 graus Celsius e utilizada no prazo de poucas semanas. Devem evitar-se ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, assim como uma exposicao prolongada a temperatura ambiente, dado que a instabilidade proteolitica do tripeptido esta documentada (Songok et al., 2018). Ao preparar, recomenda-se deixar o solvente escorrer lentamente pela parede do frasco, em vez de dirigir o jato diretamente sobre o po, para minimizar o stress mecanico. A pureza do material de partida, habitualmente indicada com valores de 98 por cento ou superiores, deve ser documentada atraves de um certificado de analise, ja que os fornecedores de investigacao nao regulados podem variar fortemente em qualidade e perfil de impurezas. Uma documentacao rigorosa de cada lote e indispensavel para obter resultados de investigacao reproduziveis.

Que efeitos secundarios sao conhecidos a partir de estudos?

Para o KPV nao existem dados de seguranca humanos controlados. Em trabalhos de revisao, os analogos da alpha-MSH sao descritos de forma geral como substancias com um perfil de seguranca favoravel, mas uma toxicologia especifica para o KPV nao e apresentada em detalhe (Dinparastisaleh e Mirsaeidi, 2021). Uma caracteristica distintiva importante e que o KPV, ao contrario da alpha-MSH completa e ao contrario dos agonistas do MC1R do tipo melanotan, nao desencadeia qualquer pigmentacao. Desaparece assim uma das propriedades frequentemente discutidas dos peptidos baseados em melanocortina.

Preocupacoes teoricas e anedoticas razoaveis dizem respeito a reacoes no local da injecao, a uma possivel imunogenicidade, bem como ao risco decorrente da pureza do produto e de impurezas provenientes de fontes de investigacao nao reguladas. Dado que o KPV suprime o fator de transcricao NF-kB e atenua as respostas de citocinas inatas, efeitos imunossupressores amplos ou cronicos sao um aspeto plausivel, mas ate agora nao estudado. Os estudos apontam para que o efeito afete seletivamente as vias de sinalizacao pro-inflamatorias, mas faltam por completo dados de longo prazo sobre possiveis consequencias de uma atenuacao duradoura da resposta imunitaria inata. O KPV destina-se exclusivamente a fins de investigacao e nao esta previsto para aplicacao terapeutica em humanos. Qualquer trabalho com o peptido deve ser realizado em condicoes de laboratorio e com medidas de seguranca documentadas.

Em que difere o KPV do BPC-157, do Selank e da Thymosin Alpha-1?

O KPV distingue-se claramente de outros peptidos de investigacao pela origem, tamanho e mecanismo de acao. Em relacao ao BPC-157, a diferenca e fundamental: o BPC-157 e um fragmento sintetico de 15 aminoacidos do Body Protection Compound gastrico humano e e associado na investigacao a angiogenese atraves da via de sinalizacao VEGFR2-eNOS, bem como a regeneracao de tecidos, tendoes e intestino. O KPV, por sua vez, e um tripeptido de tres aminoacidos com a marca de um bloqueio intracelular do NF-kB dependente de PepT1. Estrutura de origem, tamanho, via de transporte e mecanismo primario diferem por completo (Dalmasso et al., 2008; Land, 2012).

O Selank e um analogo heptapeptidico sintetico do peptido imunomodulador tuftsina, desenvolvido como substancia com acao ansiolitica e nootropica atraves das vias de sinalizacao GABAergica, monoaminergica e de BDNF no sistema nervoso central. O KPV nao e neuroativo e atua sobre a inflamacao NF-kB periferica e epitelial; a origem e o sistema alvo nao tem relacao. A Thymosin Alpha-1, por fim, e um peptido timico de 28 aminoacidos que atua de forma amplamente imunoestimuladora, ao promover a maturacao das celulas T, bem como a sinalizacao TLR e das celulas dendriticas. O KPV situa-se, com a sua orientacao imunossupressora e anti-inflamatoria, na extremidade oposta do espetro imunomodulador e difere por completo em tamanho e origem.

Porque e que o KPV nao desencadeia pigmentacao?

Esta questao e central para a compreensao da seletividade do KPV. A alpha-MSH completa ativa o recetor de melanocortina 1 (MC1R) nos melanocitos e desencadeia atraves dele uma resposta mediada por cAMP que conduz a formacao de melanina e, com isso, a pigmentacao. E precisamente este eixo que os agonistas do MC1R do tipo melanotan aproveitam. O KPV, enquanto tripeptido C-terminal, transporta no entanto a atividade anti-inflamatoria da hormona, sem desencadear a resposta pigmentar MC1R-cAMP nos melanocitos (Land, 2012).

A razao reside no modo de acao dominante do tripeptido, independente de recetores. Enquanto a pigmentacao exige uma ativacao completa e classica do recetor, o efeito anti-inflamatorio do KPV baseia-se predominantemente no bloqueio intracelular da translocacao nuclear do NF-kB apos a captacao por PepT1. Uma componente secundaria, parcialmente mediada por recetores, atraves de MC3R e MC1R, esta de facto descrita nos epitelios das vias respiratorias e noutros epitelios, mas nao e suficiente para iniciar a cascata pigmentar de cAMP nos melanocitos (Dinparastisaleh e Mirsaeidi, 2021). Para a investigacao, esta separacao significa que e possivel estudar as propriedades anti-inflamatorias do sistema alpha-MSH sem introduzir o efeito pigmentar confundidor. Esta seletividade e uma das razoes pelas quais o KPV ganhou importancia como peptido modelo para a modulacao da inflamacao mediada por melanocortina.

Qual a importancia do PepT1 para a seletividade tecidual?

O transportador PepT1 e a chave para compreender porque e que o KPV pode ser localmente eficaz apesar da falta de estabilidade sistemica. O PepT1 e um transportador de di e tripeptidos que e expresso nas celulas epiteliais intestinais e nas celulas imunitarias. Atraves dele, o KPV chega ao interior da celula, onde desenvolve o seu efeito anti-inflamatorio. A afinidade e dependente do tecido: nas celulas epiteliais intestinais o valor de Km situa-se em cerca de 160 uM, nas celulas imunitarias Jurkat em torno de 700 uM (Dalmasso et al., 2008).

Esta captacao dependente do transportador explica o aparente paradoxo entre a rapida instabilidade proteolitica e a eficacia local documentada. No modelo de colite em ratinho, a inflamacao foi reduzida apesar da conhecida suscetibilidade do peptido as peptidases, porque o PepT1 introduz o tripeptido nas celulas diretamente no tecido intestinal afetado, antes mesmo de ser necessario qualquer transporte sistemico. A eficacia e, assim, uma questao de captacao celular local e nao de exposicao sistemica. Para a investigacao, dai resulta uma imagem mecanistica clara: os tecidos com elevada expressao de PepT1, em particular o epitelio intestinal, sao os sistemas modelo mais plausiveis para o estudo do KPV. Os estudos apontam para que o bloqueio do NF-kB atue de forma mais eficiente onde o transportador permite a acumulacao intracelular do peptido.

Perguntas frequentes sobre o KPV

O KPV esta aprovado para aplicacao em humanos?

Nao. O KPV nao esta aprovado pela FDA nem por uma autoridade comparavel e nao possui doses humanas terapeuticas estabelecidas. Todos os dados disponiveis provem de modelos in vitro e animais, e o peptido destina-se exclusivamente a fins de investigacao (Dalmasso et al., 2008).

O KPV tem uma semivida conhecida?

Uma semivida sistemica validada em humanos nao existe na literatura cientifica. Os valores frequentemente referidos de cerca de 30 minutos nao sao atribuiveis a um estudo primario humano de PK e sao considerados valores estimados nao verificados. Como tripeptido nao protegido, o KPV e rapidamente degradado por peptidases (Songok et al., 2018).

O KPV provoca um bronzeamento da pele?

Nao. Ao contrario da alpha-MSH completa ou dos agonistas do MC1R do tipo melanotan, o KPV nao desencadeia a resposta pigmentar MC1R-cAMP nos melanocitos e transporta assim a atividade anti-inflamatoria sem efeitos pigmentares (Land, 2012).

Como deve o KPV ser armazenado apos a reconstituicao?

Segundo a recomendacao de precaucao do manuseamento geral de peptidos, a solucao reconstituida e mantida refrigerada a 2 a 8 graus Celsius e utilizada no prazo de poucas semanas. Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e temperatura ambiente prolongada devem ser evitados, devido a instabilidade proteolitica documentada (Songok et al., 2018).

Em que difere o KPV da Thymosin Alpha-1?

O KPV atua de forma anti-inflamatoria e imunossupressora, ao atenuar o NF-kB e as citocinas pro-inflamatorias. A Thymosin Alpha-1, pelo contrario, e um peptido claramente maior, de 28 aminoacidos, e atua de forma imunoestimuladora. Ambos se situam em extremidades opostas do espetro imunomodulador (Dinparastisaleh e Mirsaeidi, 2021).

Apenas para fins de investigacao. Nao se destina ao consumo humano. Redacao cientifica: Dr. Sieglinde Klaus