Cum cititi corect puritatea HPLC si CoA la peptide
Dr. Sieglinde Klaus
Redacție științifică · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Redacție științifică · Bergdorf Bioscience
Puritatea HPLC indica ce procent din suprafata unei cromatograme revine peptidei tinta, in timp ce Certificatul de Analiza (CoA) documenteaza aceasta valoare impreuna cu identitatea confirmata prin spectrometrie de masa, lotul si metodele de analiza. O valoare de >=99% inseamna ca, in semnalul detectorului UV, doar o suprafata foarte mica revine componentelor secundare. Acest ghid explica modul in care se obtin ambele indicatii si cum le puteti verifica.
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC) separa un amestec peptidic dizolvat dupa proprietatile fizico-chimice si arata astfel din cate componente este alcatuita o proba. In analiza peptidelor domina HPLC in faza inversa (RP-HPLC) pe coloane C18, C8 sau C4, deoarece aceasta separa moleculele dupa hidrofobicitate si ofera in acelasi timp o rezolutie ridicata. Conform sintezei metodologice realizate de Mant et al., 2007, HPLC este considerata de peste 25 de ani cea mai versatila metoda pentru izolarea si determinarea puritatii peptidelor sintetice.
Concret, o faza mobila, de regula un gradient de apa si acetonitril cu 0,05 pana la 0,1% acid trifluoracetic (TFA), trece prin coloana. Fiecare componenta paraseste coloana la un moment caracteristic, timpul de retentie, si genereaza la detectorul UV (de obicei 214 sau 220 nm, unde absoarbe legatura peptidica) un peak. Asadar, HPLC nu masoara identitatea unei substante, ci comportamentul ei de separare si proportia relativa din cantitate. Pentru o afirmatie privind identitatea este nevoie de o a doua metoda, spectrometria de masa.
Indicatia procentuala a puritatii HPLC descrie ponderea suprafetei peakului principal din suprafata totala a tuturor peakurilor detectate. La 99%, deci, 99% din suprafata integrata a semnalului UV revine peptidei tinta si doar 1% tuturor componentelor secundare la un loc. Este important de retinut ca este vorba despre o indicatie relativa de suprafata, nu despre o indicatie de masa: solventii reziduali, sarurile sau apa, care absorb foarte putin la 214 nm, nu sunt incluse in aceasta valoare. De aceea, producatorii seriosi completeaza puritatea HPLC cu alti indicatori, precum continutul net de peptida.
Componentele secundare provin de cele mai multe ori din sinteza pe faza solida. Conform Boysen & Hearn, 2006, in sinteza pas cu pas apar mai ales secvente cu deletie (un aminoacid lipsa), secvente scurtate, precum si produse rezultate din deprotectie incompleta sau racemizare. Tocmai aceste impuritati foarte asemanatoare din punct de vedere chimic sunt greu de separat si determina cat de mare poate fi puritatea obtenabila. Un salt de la 95% la 99% inseamna, prin urmare, ca aceste specii inrudite au fost in mare parte indepartate. Mai mult context despre clasa de substante in sine gasiti in ghidul Ce sunt peptidele?.
Un CoA este protocolul de analiza al unui lot concret si reuneste rezultatele tuturor analizelor efectuate intr-un singur document. De regula, acesta indica numele produsului, formula moleculara si greutatea moleculara teoretica, numarul lotului, data de fabricatie sau de analiza, precum si metodele aplicate. Nucleul il formeaza doua blocuri: confirmarea identitatii prin spectrometrie de masa si determinarea puritatii prin HPLC. Adesea sunt indicate suplimentar si aspectul vizual (liofilizat alb) si continutul de apa.
Esential este ca un CoA solid sa prezinte datele originale, nu doar sa afirme o cifra. Aici se incadreaza cromatograma HPLC reprezentata grafic, cu timp de retentie si suprafete de integrare, precum si spectrul de masa cu valoarea m/z masurata. Astfel, o persoana de specialitate poate verifica afirmatiile, in loc sa le creada pur si simplu. Indicatiile despre metoda ar trebui sa fie precise, de exemplu tipul coloanei, gradientul, lungimea de unda de detectie si procedeul de ionizare utilizat. La BergdorfBio, CoA-ul aferent lotului serveste drept dovada pentru promisiunea de puritate HPLC >=99% si CoA mentionata pe pagina de pornire. Produse precum BPC-157 sau Retatrutida sunt livrate fiecare impreuna cu un astfel de document aferent lotului.
In timp ce HPLC arata doar comportamentul de separare, spectrometria de masa raspunde la intrebarea daca este prezenta molecula corecta. In analiza peptidelor domina ionizarea prin electrospray (ESI), un procedeu de ionizare bland care transfera moleculele in faza gazoasa fara fragmentare. Conform Banerjee & Mazumdar, 2012, ESI genereaza ioni cu sarcina multipla, prin care intervalul masurabil m/z se extinde considerabil si pot fi determinate cu precizie si peptide de dimensiuni mari.
Pe CoA, greutatea moleculara masurata este comparata cu valoarea teoretica, calculata din formula moleculara. Daca ambele coincid pana la cateva unitati de masa, identitatea peptidei este confirmata. O abatere de, de exemplu, 18 unitati de masa ar putea indica o pierdere de apa, o diferenta mai mare o secventa gresita sau contaminata. Cuplarea ambelor metode, deci LC-MS, este deosebit de concludenta: Toll et al., 2005 au aratat ca peste 50 de peptide dintr-o digestie tripsica au putut fi separate in 15 pana la 20 de minute si identificate simultan prin ESI-MS. Identitatea si puritatea sunt astfel inregistrate intr-o singura analiza.
Cromatograma este mesajul grafic esential al fiecarui CoA: pe axa x se afla timpul in minute, pe axa y raspunsul detectorului, de regula in miliunitati de absorbanta (mAU). Peptida tinta apare ca un peak principal inalt si ingust, la timpul ei de retentie caracteristic, de exemplu intre 8 si 12 minute, in functie de metoda. O proba prelucrata curat arata un singur peak ascutit si simetric, cu o separare clara fata de linia de baza in raport cu eventualele peakuri secundare.
Cand cititi, fiti atenti la trei aspecte. In primul rand, forma peakului: un peak puternic asimetric (tailing) sau o baza largita pot indica impuritati care coeluiaza sau probleme ale coloanei. In al doilea rand, peakurile secundare mici: acestea reprezinta produse secundare de sinteza; suma suprafetelor lor da procentul care lipseste pana la marca de 100%. In al treilea rand, linia de baza: aceasta ar trebui sa ramana plata si linistita, fara deriva. Integrarea, deci determinarea matematica a suprafetei de sub fiecare peak, ofera in final cifrele procentuale. O faza mobila care contine TFA imbunatateste in acest proces claritatea peakului, deoarece TFA, ca reactiv de imperechere ionica, mascheaza lanturile laterale bazice ale peptidei si genereaza astfel un comportament de eluare mai omogen (Mant et al., 2007).
O singura indicatie procentuala lipsita de context valoreaza putin, deoarece depinde de metoda. Aceeasi proba poate furniza valori usor diferite pe doua coloane diferite sau la doua lungimi de unda de detectie, deoarece separarea si absorbtia UV a componentelor secundare variaza. O puritate de 99%, masurata la o singura lungime de unda, convinge abia atunci cand metoda este documentata complet si cromatograma aferenta este atasata. O cifra goala, fara spectru, nu poate fi verificata.
La aceasta se adauga faptul ca puritatea HPLC nu inregistreaza componentele inactive in UV. Sarurile din procesul de sinteza si de purificare, precum contraionii de acetat sau trifluoracetat, precum si apa reziduala contribuie cu masa fara sa apara in cromatograma. De aceea, continutul net de peptida, determinat adesea prin analiza aminoacizilor sau determinarea azotului, este o completare utila: el indica exact cat peptida pura este de fapt continuta intr-un miligram de pulbere. Identitatea (MS), puritatea relativa (HPLC) si continutul absolut sunt trei intrebari diferite, la care un CoA bun raspunde separat.
Fiecare serie de sinteza este un proces chimic propriu, cu variatii proprii, motiv pentru care un CoA trebuie sa fie intotdeauna asociat unui lot concret. O fisa tehnica generica, menita sa fie valabila pentru toate unitatile produse vreodata dintr-un produs, nu este o dovada de analiza, ci o afirmatie publicitara. Abia numarul lotului de pe document leaga valorile masurate de materialul fizic din fiola aflata in fata dumneavoastra. Timpul de retentie, spectrul de masa si puritatea sunt valabile exact pentru aceasta unitate de productie.
Acest lucru este relevant si pentru ca profilul de impuritati poate diferi de la un lot la altul. Un lot atinge poate 99,2%, altul 98,6%, cu un tipar de peakuri secundare usor diferit. Doar un CoA legat de lot reflecta aceasta realitate. Practic, ar trebui sa comparati numarul lotului de pe eticheta cu cel de pe CoA, sa verificati data analizei si sa va asigurati ca este atasata efectiv cromatograma. Daca lipseste asocierea cu lotul sau fisa de date originala, indicatia de puritate nu poate fi verificata, indiferent cat de mare este cifra.
Peakurile mici de langa peakul principal nu sunt o intamplare, ci au cauze chimice definite. Din sinteza pe faza solida provin mai ales peptide cu deletie, la care, in timpul constructiei, a fost omis un aminoacid, precum si secvente scurtate, prin intreruperea prematura a lantului. Pe langa acestea apar produse de deprotectie incompleta, la care grupele protectoare raman pe molecula, precum si produse de racemizare cu stereochimie modificata. Aceste specii inrudite se deosebesc adesea doar minimal de peptida tinta si eluiaza in consecinta aproape de peakul principal.
Dupa depozitare se pot adauga si alte produse de degradare. Conform sintezei realizate de Lai & Topp, 1999, printre cele mai importante reactii chimice in stare solida se numara dezamidarea, scindarea legaturii peptidice, oxidarea, reactia Maillard, beta-eliminarea si agregarea. In cromatograma, astfel de procese se manifesta sub forma de peakuri secundare noi sau in crestere. Prin urmare, un CoA intocmit imediat dupa sinteza documenteaza starea initiala; profilul real din laboratorul de cercetare depinde suplimentar de manipulare si de depozitare.
Puritatea documentata pe CoA este valabila pentru momentul masuratorii, de regula imediat dupa sinteza si purificare. De aceea, peptidele de cercetare sunt livrate aproape intotdeauna ca liofilizat, deci ca pulbere uscata prin liofilizare, deoarece eliminarea apei incetineste puternic caile de degradare hidrolitica si oxidativa. Conform Lai & Topp, 1999, stabilitatea chimica in stare solida este determinata in mod hotarator de temperatura, umiditatea reziduala si starea de agregare; chiar si o umiditate reziduala redusa poate accelera agregarea.
Practic, acest lucru inseamna: cea mai frumoasa indicatie de 99% foloseste putin daca materialul este apoi depozitat necorespunzator. O pastrare la rece, uscat si ferit de lumina a liofilizatului inchis mentine cel mai mult timp profilul documentat pe CoA. Daca o peptida este reconstituita, deci adusa in solutie, reactiile de degradare dependente de apa incep sa se desfasoare mai rapid, iar cromatograma initiala isi pierde valabilitatea. Cine doreste sa interpreteze corect datele de puritate trebuie, asadar, sa diferentieze intre momentul masuratorii si cel al utilizarii: CoA descrie starea la livrare, nu starea permanenta pe intreaga durata de utilizare.
O verificare sistematica dureaza doar cateva minute si face concrete valorile abstracte. Parcurgeti documentul in aceasta ordine:
Daca lipseste vreunul dintre aceste puncte, CoA este incomplet. Deosebit de critica este lipsa graficelor originale: fara cromatograma si spectru, cifra puritatii ramane o simpla afirmatie. In schimb, un document complet, legat de lot, cu toate datele brute, este cel mai puternic semnal de calitate pe care il poate avea o peptida de cercetare. El va permite sa verificati singuri afirmatiile, in loc sa va bazati pe o cifra izolata.
Puritatea HPLC este o indicatie relativa de suprafata si arata ce proportie din componentele active in UV revine peptidei tinta. Continutul de peptida, in schimb, indica cat peptida pura este continuta intr-un miligram de pulbere totala si tine cont si de componentele inactive in UV, precum sarurile si apa reziduala. Ambele valori se completeaza reciproc si ar trebui privite separat.
Nu automat, deoarece cifra depinde de metoda. O cromatograma documentata la 98% poate fi mai concludenta decat o indicatie goala de 99%, fara date originale. Esential este ca puritatea sa fie sustinuta de o cromatograma verificabila, legata de lot, si ca metoda de masurare sa fie clar indicata.
HPLC separa doar dupa proprietatile fizico-chimice si arata comportamentul de separare, nu compozitia moleculara. Doua molecule diferite ar putea eluia teoretic in mod similar. Abia spectrometria de masa masoara greutatea moleculara si confirma, prin compararea cu valoarea teoretica, ca este prezenta cu adevarat peptida tinta.
Un CoA documenteaza starea la momentul analizei, de regula imediat dupa sinteza. El ramane valabil ca dovada a provenientei, dar nu descrie starea dupa o depozitare indelungata sau necorespunzatoare. Fiti atenti la o data a analizei mentionata si tineti cont ca puritatea reala depinde de conditiile de depozitare.
Numai in scopuri de cercetare. Nu este destinat consumului uman. Redactie stiintifica: Dr. Sieglinde Klaus
