Förvara peptider och hållbarhet: den kompletta guiden
Dr. Sieglinde Klaus
Vetenskaplig redaktion · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Vetenskaplig redaktion · Bergdorf Bioscience
Lyofiliserade forskningspeptider håller sig som mest stabila om de förvaras torrt, mörkt och djupfryst: vid -20 grader Celsius i flera år, eventuellt -80 grader Celsius för längsta möjliga hållbarhet. Rekonstituerade lösningar hör hemma i kylskåp vid 2 till 8 grader Celsius och bör förbrukas inom några få veckor. Upprepad infrysning och upptining är molekylintegritetens största fiende.
Peptider är korta aminosyrakedjor vars funktion hänger på en exakt kemisk struktur. Redan små nedbrytningsprocesser kan mätbart sänka renheten hos ett forskningspreparat. De avgörande nedbrytningsvägarna är hydrolys av peptidbindningen, oxidation av känsliga rester som metionin, cystein och tryptofan samt deamidering av asparagin och glutamin. Dessa reaktioner sker desto snabbare ju mer vatten, värme, ljus och syre som finns närvarande.
I en omfattande översikt om stabiliteten hos proteinläkemedel beskriver Manning et al., 2010 både kemisk instabilitet (deamidering, oxidation, hydrolys, racemisering) och fysikalisk instabilitet (aggregation, utfällning, denaturering, adsorption till ytor) som de centrala mekanismerna. Avgörande för det praktiska arbetet: dessa två kategorier är kopplade till varandra, en kemiskt förändrad molekyl är mer benägen att aggregera.
För laboratorieförvaring av forskningsmaterial innebär det en tydlig princip: avlägsna vatten eller frys fast molekylernas rörlighet. Lyofiliserade (frystorkade) peptider befinner sig i en torr, glasartad matris där nedbrytningsreaktioner praktiskt taget avstannar. Så snart vatten tillkommer börjar klockan ticka. Den som vill maximera hållbarheten minimerar därför fukt, håller temperaturen låg och minskar kontakten med luft och ljus under hela lagringstiden.
Den mest stabila formen av en forskningspeptid är det lyofiliserade pulvret. Vid frystorkning avlägsnas vatten under vakuum, så att en amorf, glasartad matris bildas, vilken fixerar molekylerna fysiskt och drastiskt bromsar hydrolytiska och oxidativa processer. Wang, 200000423-3) beskriver i sin inflytelserika översikt att proteiner ofta måste överföras till fast form för att uppnå en acceptabel hållbarhet, och att lagringstemperaturen bör ligga klart under glasövergångstemperaturen.
I den praktiska laboratorievardagen gäller: lyofiliserat pulver förvaras vid -20 grader Celsius, vilket för de flesta sekvenser möjliggör en stabilitet på flera år. För särskilt känsliga peptider, exempelvis sådana med cystein- eller metioninrester, eller för en planerad lagring över flera år är -80 grader Celsius att föredra, eftersom nedbrytningen då förblir nästintill försumbar.
Viktigt är ett lufttätt förslutet kärl. Restfukt är den kritiska faktorn: redan små mängder vatten sänker den kemiska stabiliteten, varför originalflaskan bör förbli försluten och ett torkmedel i lagringsbehållaren kan vara klokt. Undvik dessutom frostfria (No-Frost-) frysar, eftersom deras automatiska avfrostningscykler periodiskt höjer temperaturen och därmed skapar oavsiktliga delvisa upptiningar. Märk varje kärl med substans, sats och ankomstdatum så att hållbarheten går att spåra. En konstant, låg temperatur utan svängningar är värdefullare än ett tillfälligt ännu lägre värde.
Så snart en peptid har rekonstituerats med bakteriostatiskt vatten lämnar den den skyddande torra formen och befinner sig åter i en vattenhaltig miljö där hydrolys och oxidation pågår aktivt. Den rekonstituerade lösningen hör därför hemma i kylskåp vid 2 till 8 grader Celsius och bör inte stå framme i rumstemperatur. I detta temperaturintervall förblir många peptider användbara i några veckor, beroende på sekvens och känslighet.
Tillsatsen bakteriostatisk verkar avgörande: bakteriostatiskt vatten innehåller 0,9 procent bensylalkohol, som hämmar mikrobiell tillväxt och därigenom över huvud taget gör en kylskåpslagring av lösningen i flera veckor meningsfull. Rent vatten utan konserveringsmedel ger inte detta skydd. Det exakta tillvägagångssättet vid upplösning förklaras i vår guide om att rekonstituera peptider.
Buffertkemin påverkar stabiliteten mätbart. Oxidation och deamidering är pH- och temperaturberoende: Manning et al., 2010 visar att deamidering förlöper baskatalyserat och sker särskilt snabbt i sekvenser med asparagin-glycin, medan metioninoxidation når sitt maximum i det neutrala området. För laboratoriearbetet betyder det: håll svalt, skydda mot ljus, tillåt så lite luftkontakt som möjligt och bevara inte lösningen längre än nödvändigt. Den som rekonstituerar större mängder bör fundera på att dela upp i alikvoter, något vi behandlar i nästa avsnitt.
Varje frys-töcykel stressar lösta peptider på fysikalisk nivå. Vid frysning bildas iskristaller, vars tillväxt skapar mekaniska krafter och tvingar molekylerna i nära kontakt; samtidigt koncentreras lösta ämnen upp i de återstående flytande områdena, vilket lokalt skapar extrema förhållanden. Resultatet är aggregation och en smygande förlust av intakt verksamt ämne.
Jain et al., 2021 undersökte i Scientific Reports specifikt frys-töstressen hos en monoklonal antikropp och visade att aggregationen kan minskas signifikant genom optimerade frys- och upptiningsförhållanden. Studien ger en ram för hur skador kan minimeras från laboratorieskala till produktion. Den överförbara insikten: det är inte själva infrysningen som är problemet, utan förhållandena och hur ofta cyklerna sker.
I praktiken innebär det en enkel regel: begränsa antalet frys-töcykler. Korta, enkla peptider tål ofta flera cykler med liten förlust, medan längre och mer komplext veckade sekvenser redan efter två till tre cykler kan ta mätbar skada. Snabb frysning vid -80 grader Celsius och rask upptining i rumstemperatur håller belastningen inom en cykel låg. Den som om och om igen fryser in och tinar samma stamlösning påskyndar nedbrytningen i onödan. Lösningen är att alikvotera.
Alikvotering betecknar uppdelningen av en rekonstituerad stamlösning i flera små portioner (alikvoter) som fryses in separat. I stället för att tina och frysa in ett enda kärl vid varje uttag tinar man bara den alikvot man behöver just då. Varje flaska genomgår på så sätt idealiskt exakt en frys-töcykel, i stället för många. Denna en-upptining-princip betraktas i laboratoriepraxis som det mest verksamma skyddet mot frys-tö-betingad nedbrytning.
Skälet ligger i nedbrytningens ojämnhet: varje upptining är ett tillfälle för partiell degradering, aggregation eller adsorption till kärlväggen, och dessa förändringar fördelar sig inte jämnt över alla molekyler. Genom att tidigt dela upp stamlösningen i portioner fryser man in merparten i ett definierat utgångstillstånd. Rekommendationen från Jain et al., 2021 att kontrollera frys-töförhållandena låter sig på så sätt direkt översättas till ett enkelt arbetsprotokoll.
Praktiskt delar man upp lösningen i sterila, märkta mikrorör vars storlek anpassas efter den vanliga förbrukningen per experiment. Använd proteinlåga kärl för att minska adsorptionsförluster, och fyll inte upp till brädden, eftersom fryssande vätska utvidgas. Märk varje alikvot med substans, koncentration och datum. Outnyttjade rester av en upptinad alikvot kasseras i stället för att frysas in på nytt. På så sätt behåller huvudförrådet en konstant kvalitet i månader, medan endast små mängder utsätts för upptiningsstress.
Vid sidan av vatten och värme är ljus och syre två ofta underskattade nedbrytningsdrivare. Oxidation berör framför allt de svavelhaltiga resterna metionin och cystein samt det aromatiska tryptofanet. Metionin oxiderar till metioninsulfoxid och vidare till sulfonet, varvid denna omvandling är praktiskt taget irreversibel. Syre från luften och ljus påskyndar denna process, varför kontakten med båda bör minimeras.
Badgett et al., 2017 visade med hjälp av HILIC-masspektrometri att peptider med oxiderat metionin och deamiderat asparagin går att separera rent från sina oförändrade motsvarigheter och kvantifiera. Det styrker att dessa modifieringar är verkliga, mätbara förändringar, inte teoretiska risker. För förvaringen följer därav att varje åtgärd för att minska ljus- och luftexponering bevarar den intakta andelen.
Konkret betyder det: förvara peptider i ljusogenomträngliga eller bärnstensfärgade behållare respektive i originalkartongen, borta från fönsterljus och UV-källor. Håll kärlet förslutet mellan uttagen för att begränsa luftkontakten. För särskilt oxidationskänsliga sekvenser kan ett skikt av en inert gas som kväve eller argon tränga undan restsyret i kärlets gasrum. I kombination med låg temperatur och torrhet ger skyddet mot ljus och syre ett heltäckande skyddskoncept som tydligt förlänger den användbara hållbarheten hos forskningsmaterial.
Hjälpämnen (excipienter) i den lyofiliserade produkten bidrar väsentligt till lagringsstabiliteten. Disackarider som trehalos och sackaros betraktas som de mest verksamma lyoprotektorerna: de bildar vätebindningar till peptidens polära grupper och ersätter därmed den stabiliserande roll som det avlägsnade vattnet hade i den glasartade matrisen. Karunnanithy et al., 2024 rapporterar att trehalos ofta presterar bättre än sackaros, eftersom dess långsammare molekylära rotation stör proteinstrukturen mindre.
Lika avgörande är restfukten i det färdiga lyofilisatet. En låg restfukt håller produkten under glasövergångstemperaturen och därmed i det stabila glasartade tillståndet; stiger fukten sjunker den kemiska stabiliteten oberoende av om materialet är glasartat eller redan gummiartat. Dessa samband går tillbaka på det grundläggande arbetet av Wang, 200000423-3), som behandlar kryo- och lyoprotektion utförligt.
För lagringspraktiken följer flera hävstänger av detta. Förvara peptiden i originalflaskan med intakt septum för att förhindra fuktupptag. Lägg ett torkmedel (silikagel) i den omgivande lagringsbehållaren, särskilt när kärl tas ut ur frysen, eftersom kondensvatten bildas vid uppvärmning. Låt därför förslutna flaskor anta rumstemperatur innan de öppnas, så att ingen fukt kondenserar in i kärlet. Dessa små försiktighetsåtgärder skyddar den mödosamt uppbyggda torrstabiliteten och förhindrar att inträngd fukt förkortar hållbarheten.
En nedbruten eller kontaminerad peptid går delvis att känna igen med blotta ögat, delvis bara analytiskt. För det lyofiliserade pulvret gäller: ett intakt preparat framträder som en jämn vit till krämfärgad kaka eller ett fint pulver. Iögonfallande missfärgningar, en hopfallen eller förvätskad kaka eller synlig fukt i flaskan är varningstecken på fuktinträngning eller felaktig förvaring.
Efter rekonstitution bör ett korrekt löst prov vara klart och partikelfritt. Grumlighet, slöjor, flockar eller en synlig fällning tyder på aggregation eller mikrobiell kontamination, båda tecken på att materialet är olämpligt för tillförlitliga forskningsresultat. Som beskrivits ovan är aggregation en direkt följd av frys-töstress och fysikalisk instabilitet, vilken Manning et al., 2010 anger som en kärnmekanism.
Den tillförlitliga bedömningen av renheten sker dock instrumentellt. Metoden från Badgett et al., 2017 visar att oxiderade och deamiderade varianter kan separeras kromatografiskt från den intakta arten och kvantifieras; i praktiken används för detta HPLC och masspektrometri. Synliga förändringar är alltså bara det grova första steget. För kvantitativ forskning rekommenderas att dokumentera ankomstdatumet, protokollföra synliga avvikelser och vid tvivel ta till en analytisk karakterisering innan tvivelaktigt material förs in i ett experiment.
Den realistiska hållbarheten beror starkt på peptidens tillstånd. Som lyofiliserat pulver vid -20 grader Celsius förblir många sekvenser stabila i flera år; vid -80 grader Celsius är nedbrytningen så liten att en mycket lång lagring är möjlig. Vid rumstemperatur förkortas däremot den användbara hållbarheten drastiskt, eftersom hydrolys och oxidation sker betydligt snabbare.
Rekonstituerade lösningar är avsevärt kortlivade. I kylskåp vid 2 till 8 grader Celsius gäller, beroende på sekvens och känslighet, några veckor som vanlig ram; oxidations- eller deamideringskänsliga peptider ligger i den nedre delen av detta spann. Just därför är tidig alikvotering och infrysning vid -20 eller -80 grader Celsius så värdefull: den överför den kortlivade lösningen tillbaka till ett mer långlivat tillstånd utan att utsätta den för upprepad upptiningsstress.
De exakta talen varierar beroende på sekvens, formulering och förekommande hjälpämnen, varför Manning et al., 2010 betonar att sekvens, känsliga rester och formulering tillsammans bestämmer stabiliteten. Behandla därför hållbarhetsuppgifter som sekvensberoende riktvärden, inte som fasta garantier. En bra tumregel för laboratoriet: torrt och djupfryst, tänk i år; löst och kylt, tänk i veckor. Den som är osäker vid upplösningen finner grunderna i vår guide Vad är peptider? samt i den detaljerade anvisningen om rekonstituering.
I princip ja, men varje ytterligare frys-töcykel ökar risken för aggregation och förlust av verksamt ämne. Jain et al., 2021 visar att frys-töskador kan minskas genom kontrollerade förhållanden. Klart bättre är det dock att alikvotera lösningen från början och tillåta endast en enda upptining per alikvot.
För många lyofiliserade peptider är -20 grader Celsius tillräckligt, förutsatt att apparaten inte har ett No-Frost-system med automatiska avfrostningscykler, eftersom dessa periodiskt höjer temperaturen. För flerårig lagring eller särskilt känsliga sekvenser är en -80-graders-frys att föredra, eftersom nedbrytningen där nästintill avstannar.
Kallt glas drar åt sig kondensvatten vid kontakt med rumsluft. Öppnar man en iskall flaska direkt hamnar fukt på pulvret och påskyndar hydrolys och nedbrytning. Låter man det förslutna kärlet först tempereras förblir innehållet torrt och den mödosamt uppnådda torrstabiliteten bevaras.
Nej, den ingående bensylalkoholen verkar antimikrobiellt, inte kemiskt stabiliserande. Den förhindrar mikrobiell tillväxt och gör därigenom kylskåpslagring av en lösning i flera veckor meningsfull, men skyddar inte mot hydrolys eller oxidation. Dessa kontrolleras fortsatt genom kylning, ljusskydd och begränsad luftkontakt.
Beroende på sekvens och känslighet gäller några veckor vid 2 till 8 grader Celsius som vanlig ram. Oxidations- eller deamideringskänsliga peptider ligger i den nedre delen. Eftersom den exakta hållbarheten är sekvensberoende dokumenterar man rekonstitutionsdatumet och kasserar lösningar med synlig grumlighet eller fällning.
Endast för forskningsändamål. For research purposes only. Not for human consumption.
Vetenskaplig redaktion: Dr. Sieglinde Klaus
Så rekonstituerar du lyofiliserade forskningspeptider med bakteriostatiskt vatten: steg, mängdberäkning och förvaring. Arbeta rent i labbet.
Was sind Peptide? Herstellung (SPPS), Reinheit (HPLC), Lyophilisierung. Mit 7 PubMed-Referenzen. Wissenschaftlich fundierter Leitfaden.