Thymosin Alpha-1: Det thymiske immunpeptid i forskningsoverblik
Dr. Sieglinde Klaus
Videnskabelig redaktion · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Videnskabelig redaktion · Bergdorf Bioscience
Thymosin Alpha-1 (Tα1, INN: Thymalfasin) er et 28 aminosyrer langt, N-terminalt acetyleret peptid fra thymus, som i forskningen undersøges som immunmodulerende peptid og biologisk responsmodifikator. Det blev oprindeligt isoleret fra kalvethymus, og dets sekvens blev bestemt (Goldstein et al., 1977). Den syntetiske lægemiddelform bærer mærkenavnet Zadaxin.
Thymosin Alpha-1 er et thymisk polypeptid, som i 1977 blev isoleret fra kalvethymus af Goldstein og kolleger og fuldstændigt sekventeret (Goldstein et al., 1977). Stoffet består af 28 aminosyrerester og tilhører klassen af immunmodulerende peptider, der i immunologien klassificeres som biologiske responsmodifikatorer. Karakteristisk er den N-terminale acetylering: Det endestående serin bærer en acetylgruppe, der bidrager med cirka 42 Da til molekylmassen og adskiller den modne form fra den ikke-acetylerede forløber (Liu et al., 2013).
Den syntetiske, farmaceutisk standardiserede form bærer det internationale generiske navn Thymalfasin og markedsføres under mærkenavnet Zadaxin. I den historiske gennemgang beskrives Tα1 som et af de længst udforskede thymuspeptider, hvis undersøgelse strækker sig over flere årtier (Camerini & Garaci, 2015). Tα1 er et varmestabilt, stærkt surt molekyle, hvis fysisk-kemiske egenskaber allerede blev dokumenteret i førstebeskrivelsen (Goldstein et al., 1977).
Vigtigt for forståelsen: Thymosin Alpha-1 er ikke et vævsreparations- eller angiogenesepeptid, men betragtes i forskningen primært som en modulator af grænsefladen mellem medfødt og adaptiv immunitet (Dominari et al., 2020).
Aminosyresekvensen for Thymosin Alpha-1 omfatter 28 rester og lyder i enkeltbogstavskoden Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN, altså acetyleret serin ved N-terminalen efterfulgt af den fuldstændige kæde frem til det endestående asparagin (Goldstein et al., 1977). Påfaldende er den høje andel af sure aminosyrer som aspartat og glutamat, der giver molekylet dets stærkt sure karakter.
Molekylmassen af den modne, N-acetylerede form ligger på cirka 3108 til 3109 Da; en massespektrometrisk karakterisering angiver 3108,79 Da (Liu et al., 2013). Den ikke-acetylerede variant har med omkring 3065 Da en lavere masse; acetylgruppen tilføjer de nævnte cirka 42 Da. Denne N-terminale acetylering er ifølge den foreliggende litteratur strukturelt betydningsfuld for den fulde biologiske aktivitet og forbedrer samtidig stabiliteten over for nedbrydning ved aminopeptidaser, da acetyleringen forlænger halveringstiden i forhold til den frie aminoform (Liu et al., 2013).
For laboratoriepraksis betyder dette, at renhed og korrekt acetylering er afgørende kvalitetskendetegn. Forskere bør kontrollere batchspecifikke analysecertifikater, som typisk angiver renhedsgrader på 98 procent eller højere samt bekræftelsen af den N-terminale acetylering. Molekylets varmestabilitet blev allerede fremhævet som et bemærkelsesværdigt træk i førstebeskrivelsen (Goldstein et al., 1977).
Thymosin Alpha-1 beskrives i forskningen som en pleiotrop immunmodulator, der primært sætter ind ved grænsefladen mellem medfødt og adaptiv immunitet (Romani et al., 2007). En central virkningsmekanisme forløber via Toll-like-receptorer: Studier tyder på, at Tα1 signalerer via TLR2 på myeloide dendritiske celler og via TLR9 på plasmacytoide dendritiske celler, og det via den MyD88-afhængige signalvej, der aktiverer IRF7 og munder ud i interferon-effektorvejen (IFN-α og IFN-γ) (Dominari et al., 2020).
På cellulært niveau fremmer Tα1 ifølge litteraturen modning og differentiering af dendritiske celler og begünstiger en Th1-polarisering. Dette ledsages af en forstærket funktion af T-celler (CD4+ og CD8+) samt NK-celler og kan i immunkompromitterede tilstande igen hæve nedsatte celletal (Dominari et al., 2020). Sideordnet stimuleres cytokiner som IFN-γ og IL-2.
Et særligt interessant aspekt er den duale regulering: Tα1 inducerer i dendritiske celler indolamin-2,3-dioxygenase (IDO) og dermed tryptofan-katabolismen, hvorved der opstår et regulatorisk miljø, der balancerer inflammation og tolerance (Romani et al., 2007). I forskningen beskrives Tα1 derfor som en endogen regulator af inflammation, immunitet og tolerance, der forstærker effektive immunsvar og samtidig kan dæmpe en overaktivering.
I den foreliggende kliniske og farmakologiske litteratur er standardregimet veldokumenteret. Det etablerede skema foreskriver 1,6 mg subkutant to gange ugentligt, hvilket tilnærmelsesvis svarer til 900 µg pr. kvadratmeter kropsoverflade; anvendelsen strækte sig i undersøgelserne typisk over seks til tolv måneder (Dominari et al., 2020). For pædiatriske eller lavvægtige studiedeltagere under 40 kg beskrives i litteraturen en vægtjusteret dosis på 40 µg pr. kilogram.
De formelle farmakokinetiske undersøgelser doserede ligeledes på grundlag af kropsoverfladen med 900 µg/m² (Rost et al., 1999). Med hensyn til tolerabiliteten af højere doseringer foreligger data, der i undersøgelser på mennesker op til 16 mg to gange ugentligt over fire uger ikke viste uønskede reaktioner (Rost et al., 1999).
Til den beregningsmæssige planlægning af hvideglasstørrelser, rekonstitutionsvolumen og resulterende injektionsmængder kan peptidet afbildes i Bergdorf-værktøjet: Beregn Thymosin Alpha-1 i peptidberegneren. På den måde kan man for eksempel se, hvordan der ud fra et 1,6-mg-hvideglas ved et rekonstitutionsvolumen på 1 ml fremkommer en koncentration på 1,6 mg/ml, og hvilken skalamarkering på en insulinsprøjte der svarer til en 1,6-mg-dosis. Alle de nævnte værdier stammer udelukkende fra forsknings- og fagoplysningslitteraturen og skal ikke forstås som en anvendelsesanbefaling på mennesker.
Efter subkutan injektion resorberes Thymosin Alpha-1 hurtigt og næsten fuldstændigt, hvilket tyder på en høj biotilgængelighed (Rost et al., 1999). Den maksimale plasmakoncentration (Tmax) nås cirka en til to timer efter injektionen. Spidskoncentrationerne (Cmax) lå ved doseringen på 900 µg/m² i området omkring 30 til 80 µg/L (Rost et al., 1999).
Fordelingsvolumenet angives til cirka 5 til 8 L, hvilket svarer til det ekstracellulære rum; som et lille, stærkt surt peptid udviser Tα1 en lav plasmaproteinbinding. Eliminationen sker ved proteolytisk nedbrydning via vævsstående og cirkulerende aminopeptidaser, hvorved den renale genfinding udgør 31 til 60 procent af dosen (Rost et al., 1999). Den terminale plasmahalveringstid ligger ifølge fagoplysningen for Thymalfasin på cirka 2 timer; det formelle farmakokinetiske studie af tre subkutane formuleringer rapporterer en eliminationshalveringstid på mindre end 3 timer (Rost et al., 1999).
Bemærkelsesværdigt er, at serumniveauerne vender tilbage til udgangsværdien inden for 24 timer, og at der ved gentagen indgivelse ikke sker nogen akkumulering (Rost et al., 1999). Netop på grund af denne korte halveringstid er der udviklet halveringstidsforlængede fusionsvarianter for at øge den ellers korte opholdstid for det native peptid (Camerini & Garaci, 2015).
Den terminale plasmahalveringstid på cirka 2 timer er litteraturunderstøttet og underbygges både af fagoplysningen for Thymalfasin og uafhængigt af det formelle farmakokinetiske studie, der fandt en eliminationshalveringstid på mindre end 3 timer ved et Tmax på en til to timer (Rost et al., 1999). Denne sammenlignelsesvis korte systemiske opholdstid forklarer to centrale observationer fra litteraturen: fraværet af akkumulering ved gentagen indgivelse og serumniveauernes tilbagevenden til udgangsværdien inden for 24 timer.
For studiedesignet har dette konkrete konsekvenser. Det i forskningen sædvanlige skema med en subkutan indgivelse to gange ugentligt står i påfaldende kontrast til den korte plasmahalveringstid. Dette antyder, at den biologiske virkning af Tα1 ikke primært er koblet til vedvarende plasmaniveauer, men til efterfølgende immunologiske effekter, for eksempel til den udløste modning af dendritiske celler og Th1-polariseringen, som tilskrives stoffet (Romani et al., 2007).
Netop dette fund har motiveret udviklingen af halveringstidsforlængede konstrukter, for eksempel Tα1-Fc-fusionsproteiner, som blev målrettet konstrueret, fordi halveringstiden for det native Tα1 er kort (Camerini & Garaci, 2015). Den, der ønsker at gennemregne eliminationsprofilen, kan bruge halveringstiden på cirka 2 timer som indgangsværdi til clearance-betragtninger.
Det kommercielle, lyofiliserede Thymalfasin leveres som pulver til rekonstitution. Ifølge produktinformationen opbevares det markedsførte præparat kølet ved 2 til 8 °C; rekonstitutionen sker med det medleverede sterile vand henholdsvis fortyndingsmiddel umiddelbart før den subkutane injektion. Disse opbevaringsangivelser stammer fra fagoplysningen, og forskere bør altid følge de batchspecifikke analysecertifikater.
Interessant er den tilsyneladende modsætning mellem molekylets intrinsiske varmestabilitet og det færdige lægemiddels kølekrav. Peptidet selv er af natur varmestabilt og stærkt surt, som allerede dokumenteret i førstekarakteriseringen (Goldstein et al., 1977). Som lyofiliseret farmaceutisk produkt opbevares det alligevel ved 2 til 8 °C, hvilket skyldes stabiliteten af den samlede formulering og ikke alene den kemiske robusthed af aminosyrekæden.
For laboratoriepraksis kan der heraf udledes klare principper: Det lyofiliserede pulver hører til i køleskabet ved 2 til 8 °C; efter rekonstitutionen bør opløsningen anvendes hurtigt. Den N-terminale acetylering bidrager til stabiliteten over for aminopeptidaser og øger kædens resistens mod enzymatisk nedbrydning (Liu et al., 2013). Konkrete opbevaringstemperaturer og anvendelsesfrister fremgår af det pågældende analysecertifikat, da disse kan variere fra batch til batch.
I den sammenfattende litteratur anses Thymosin Alpha-1 for generelt at være meget veltolereret. På tværs af mere end 2.000 behandlede patienter blev uønskede oplevelser beskrevet som sjældne og milde (Dominari et al., 2020). De rapporterede effekter omfatter lokale reaktioner på injektionsstedet som rødme eller ubehag samt en forbigående muskelatrofi, polyartralgi i form af multiple ledsmerter og en håndhvelse med hududslæt.
En plausibel forklaring på den gunstige tolerabilitet ligger i den farmakokinetiske profil: Den manglende akkumulering ved gentagen indgivelse og den korte halveringstid på cirka 2 timer bidrager ifølge litteraturen til tolerabiliteten, da peptidet ikke ophobes i organismen (Rost et al., 1999). Serumniveauerne vender tilbage til udgangsværdien inden for 24 timer, således at der ikke opstår nogen kontinuerlig systemisk eksponering.
Tolerabilitetsdataene vedrører de doseringer og anvendelsesskemaer, der er undersøgt i litteraturen. Selv i dosiseskaleringsundersøgelser på mennesker blev op til 16 mg to gange ugentligt over fire uger tolereret uden uønskede reaktioner (Rost et al., 1999). Disse angivelser tjener udelukkende den videnskabelige forståelse i forskningssammenhæng og udgør ingen udtalelse om en anvendelse på mennesker uden for kontrollerede studier.
Trods den fælles navnedel tilhører Thymosin Alpha-1 og Thymosin Beta-4 forskellige peptidfamilier med forskellige sekvenser, størrelser og funktioner. Tα1 er et 28 aminosyrer langt, N-acetyleret immunmoduleringspeptid, der virker via TLR2 og TLR9 samt signalaksen for dendritiske celler og T-celler (Dominari et al., 2020). Thymosin Beta-4, som TB-500 udgør et fragment af, er derimod et 43 aminosyrer langt, G-aktin-sekvestrerende peptid, der styrer den cytoskeletale aktindynamik, cellemigration, angiogenese og vævsreparation. Målstrukturen (Toll-like-receptorer og IDO over for aktin) og den undersøgte retning (immunrestaurering over for sårheling) adskiller sig grundlæggende.
Også BPC-157 adskiller sig klart: Der er tale om et syntetisk, 15 aminosyrer langt molekyle, der betegnes som et stabilt gastrisk pentadecapeptid, og som er afledt af et mavesæftsprotein. Dets egenskaber, der diskuteres i forskningen, vedrører cytobeskyttelse, angiogenese samt sene-, bånd- og tarmregeneration, ofte i forbindelse med VEGFR2- og eNOS-veje. Dermed er BPC-157 et regenerations- og cytobeskyttelsespeptid og ikke et thymisk immunmoduleringspeptid; oprindelse, længde (15 over for 28 aminosyrer) og mekanisme afviger tydeligt fra Tα1. Tα1 indordnes derimod som en endogen regulator af inflammation, immunitet og tolerance (Romani et al., 2007).
KPV er et tripeptid af tre aminosyrer (lysin-prolin-valin) og svarer til den C-terminale del af α-MSH-hormonet. I forskningen tilskrives KPV en antiinflammatorisk virkning, der overvejende formidles gennem undertrykkelse af proinflammatoriske NF-κB- og cytokinsignaler. KPV virker dermed som en nedregulator af inflammationsprocesser.
Thymosin Alpha-1 forfølger en modsætrettet primær retning: Som et 28 aminosyrer langt peptid forstærker og rebalancerer det den adaptive immunitet, navnlig gennem Th1-priming via aktiveringen af Toll-like-receptorer og dendritiske celler (Romani et al., 2007). Mens KPV dæmper inflammation, genopretter Tα1 immunreaktiviteten og koordinerer den. Også størrelse og målstruktur adskiller sig betydeligt: Tre aminosyrer og en NF-κB-formidlet mekanisme på KPV-siden over for 28 aminosyrer og en TLR2/TLR9-akse på Tα1-siden.
Denne sammenstilling tydeliggør, at den enkle indordning af begge peptider i kategorien af immunaktive stoffer ville være vildledende. KPV dæmper en eksisterende overaktivering, mens Tα1 ifølge den foreliggende litteratur rebalancerer et svækket eller fejlreguleret immunsvar og adresserer den duale balance mellem effektorimmunitet og tolerance via IDO-induktionen (Dominari et al., 2020).
Nej. Thymosin Alpha-1 og Thymosin Beta-4 (udgangspeptidet for TB-500) deler kun navnedelen, men tilhører forskellige peptidfamilier. Tα1 er et 28 aminosyrer langt immunmoduleringspeptid, der virker via Toll-like-receptorer, mens Thymosin Beta-4 er et 43 aminosyrer langt, aktinbindende peptid med relation til vævsreparation (Dominari et al., 2020).
Den terminale plasmahalveringstid er ifølge fagoplysningen cirka 2 timer, og det formelle farmakokinetiske studie rapporterer mindre end 3 timer. Serumniveauerne vender tilbage til udgangsværdien inden for 24 timer, og ved gentagen indgivelse sker der ingen akkumulering (Rost et al., 1999).
Acetylgruppen ved N-terminalen tilføjer cirka 42 Da til massen og er ifølge litteraturen strukturelt betydningsfuld for den fulde biologiske aktivitet. Samtidig forbedrer den stabiliteten over for nedbrydning ved aminopeptidaser og forlænger dermed halveringstiden i forhold til den frie aminoform (Liu et al., 2013).
Det lyofiliserede færdige lægemiddel opbevares ifølge produktinformationen kølet ved 2 til 8 °C og rekonstitueres umiddelbart før brug. Peptidet selv er intrinsisk varmestabilt (Goldstein et al., 1977), kølingen vedrører stabiliteten af den samlede formulering; batchspecifikke krav fremgår af analysecertifikatet.
Det i litteraturen etablerede skema lyder 1,6 mg subkutant to gange ugentligt, hvilket svarer til cirka 900 µg pr. kvadratmeter kropsoverflade (Dominari et al., 2020). For lavvægtige studiedeltagere under 40 kg beskrives en vægtjusteret dosis på 40 µg pr. kilogram. Disse angivelser tjener udelukkende forskningsformål.
Kun til forskningsformål. Ikke beregnet til konsum hos mennesker. Videnskabelig redaktion: Dr. Sieglinde Klaus