HPLC-puhtaus ja CoA peptideissä: lue ne oikein
Dr. Sieglinde Klaus
Tieteellinen toimitus · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Tieteellinen toimitus · Bergdorf Bioscience
HPLC-puhtaus ilmaisee, kuinka suuri prosentuaalinen pinta-alaosuus kromatogrammista kohdistuu kohdepeptidiin, kun taas analyysitodistus (Certificate of Analysis, CoA) dokumentoi tämän arvon yhdessä massaspektrometrialla varmistetun identiteetin, valmistuserän ja testausmenetelmien kanssa. Arvo >=99% tarkoittaa, että UV-ilmaisimen signaalissa vain hyvin pieni pinta-ala kohdistuu sivukomponentteihin. Tämä opas selittää, miten molemmat tiedot syntyvät ja miten voit tarkistaa ne.
Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) erottaa liuotetun peptidiseoksen fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan ja tekee näin näkyväksi, kuinka monesta komponentista näyte koostuu. Peptidianalytiikassa vallitseva menetelmä on käänteisfaasi-HPLC (RP-HPLC) C18-, C8- tai C4-kolonneilla, koska se erottaa molekyylit niiden hydrofobisuuden mukaan ja tarjoaa samalla korkean erotuskyvyn. Menetelmäkatsauksen Mant et al., 2007 mukaan HPLC on jo yli 25 vuoden ajan ollut monipuolisin menetelmä synteettisten peptidien eristämiseen ja puhtauden määrittämiseen.
Käytännössä liikkuva faasi, useimmiten vedestä ja asetonitriilistä koostuva gradientti, jossa on 0,05 - 0,1% trifluorietikkahappoa (TFA), virtaa kolonnin läpi. Jokainen komponentti poistuu kolonnista ominaisella ajankohdallaan, retentioajallaan, ja tuottaa UV-ilmaisimessa (tyypillisesti 214 tai 220 nm, jolla peptidisidos absorboi) piikin. HPLC ei siis mittaa aineen identiteettiä, vaan sen erottumiskäyttäytymistä ja suhteellista määräosuutta. Identiteettiväittämään tarvitaan toinen menetelmä, massaspektrometria.
HPLC-puhtauden prosenttiluku kuvaa päähuipun pinta-alaosuutta kaikkien havaittujen huippujen kokonaispinta-alasta. Arvolla 99% siis 99% integroidusta UV-signaalin pinta-alasta kohdistuu kohdepeptidiin ja vain 1% kaikkiin sivukomponentteihin yhteensä. Tärkeää on ymmärtää, että kyseessä on suhteellinen pinta-alatieto, ei painotieto: liuotinjäämät, suolat tai vesi, jotka absorboivat 214 nm:ssä vain heikosti, eivät vaikuta tähän arvoon. Siksi luotettavat valmistajat täydentävät HPLC-puhtautta muilla tunnusluvuilla, kuten netto-peptidipitoisuudella.
Sivukomponentit ovat peräisin enimmäkseen kiinteäfaasisynteesistä. Lähteen Boysen & Hearn, 2006 mukaan vaiheittaisessa synteesissä syntyy ennen kaikkea deleetiosekvenssejä (yksi puuttuva aminohappo), lyhentyneitä sekvenssejä sekä tuotteita epätäydellisestä suojaryhmien poistosta tai rasemisaatiosta. Juuri nämä kemiallisesti hyvin samankaltaiset epäpuhtaudet ovat vaikeita erottaa, ja ne määräävät, kuinka korkeaksi saavutettava puhtaus muodostuu. Loikka 95%:sta 99%:iin tarkoittaa siksi, että nämä lähisukulaiset on suurelta osin poistettu. Lisätietoa aineluokasta itsestään löydät oppaasta Mitä peptidit ovat?.
CoA on tietyn valmistuserän testauspöytäkirja, joka kokoaa kaikkien suoritettujen analyysien tulokset yhteen asiakirjaan. Tyypillisesti se ilmoittaa tuotteen nimen, summakaavan ja teoreettisen molekyylipainon, eränumeron, valmistus- tai testauspäivämäärän sekä käytetyt menetelmät. Ytimen muodostaa kaksi lohkoa: identiteetin varmistus massaspektrometrialla ja puhtauden määritys HPLC:llä. Usein lisäksi ilmoitetaan ulkonäköhavainto (valkoinen lyofilisaatti) ja vesipitoisuus.
Ratkaisevaa on, että luotettava CoA esittää alkuperäiset tiedot eikä vain väitä jotakin lukua. Tähän kuuluvat kuvattu HPLC-kromatogrammi retentioaikoineen ja integrointipinta-aloineen sekä massaspektri mitattuine m/z-arvoineen. Näin asiantunteva henkilö voi todentaa väittämät sen sijaan, että vain uskoisi ne. Menetelmätietojen tulee olla täsmällisiä, esimerkiksi kolonnityyppi, gradientti, ilmaisuaaltopituus ja käytetty ionisaatiomenetelmä. BergdorfBiossa eräkohtainen CoA toimii todisteena etusivulla mainitusta >=99%:n HPLC- ja CoA-lupauksesta. Tuotteet kuten BPC-157 tai Retatrutidi toimitetaan kukin tällaisen erään liittyvän asiakirjan kanssa.
Siinä missä HPLC näyttää vain erottumiskäyttäytymisen, massaspektrometria vastaa kysymykseen, onko kyseessä oikea molekyyli. Peptidianalytiikassa vallitseva menetelmä on sähkösumutusionisaatio (ESI), hellävarainen ionisaatiomenetelmä, joka siirtää molekyylit kaasufaasiin ilman pilkkoutumista. Lähteen Banerjee & Mazumdar, 2012 mukaan ESI tuottaa moninkertaisesti varautuneita ioneja, mikä laajentaa mitattavissa olevaa m/z-aluetta merkittävästi ja mahdollistaa myös suurten peptidien tarkan määrittämisen.
CoA:ssa mitattu molekyylipaino asetetaan vastakkain summakaavasta lasketun teoreettisen arvon kanssa. Jos molemmat täsmäävät muutaman massayksikön tarkkuudella, peptidin identiteetti on varmistettu. Esimerkiksi 18 massayksikön poikkeama voisi viitata vedenhukkaan, suurempi ero virheelliseen tai epäpuhtaaseen sekvenssiin. Molempien menetelmien yhdistäminen, eli LC-MS, on erityisen informatiivista: Toll et al., 2005 osoittivat, että yli 50 tryptisen pilkkomisen peptidiä voitiin erottaa 15 - 20 minuutissa ja samanaikaisesti tunnistaa ESI-MS:llä. Identiteetti ja puhtaus saadaan näin selville yhdellä ajolla.
Kromatogrammi on jokaisen CoA:n graafinen ydinviesti: x-akselilla on aika minuutteina, y-akselilla ilmaisimen vaste, useimmiten milliabsorptioyksikköinä (mAU). Kohdepeptidi näkyy korkeana, kapeana päähuippuna ominaisella retentioajallaan, esimerkiksi menetelmästä riippuen 8 - 12 minuutin kohdalla. Huolellisesti valmistettu näyte näyttää yksittäisen, terävän ja symmetrisen huipun, joka on selvästi perusviivasta erottunut mahdollisista sivuhuipuista.
Lukiessasi kiinnitä huomiota kolmeen asiaan. Ensinnäkin huipun muoto: voimakkaasti vino huippu (häntiminen) tai levenneet juuret voivat viitata yhdessä eluoituviin epäpuhtauksiin tai kolonnin ongelmiin. Toiseksi pienet sivuhuiput: ne edustavat synteesin sivutuotteita; niiden pinta-alasumma muodostaa puuttuvan prosenttiosuuden 100%:n rajaan. Kolmanneksi perusviiva: sen tulisi kulkea tasaisena ja rauhallisena ilman ajautumaa. Integrointi, eli kunkin huipun alapuolisen pinta-alan laskennallinen määritys, tuottaa lopulta prosenttiluvut. TFA:ta sisältävä liikkuva faasi parantaa samalla huippujen terävyyttä, sillä TFA toimii ioniparireagenssina ja peittää peptidin emäksiset sivuketjut tuottaen näin homogeenisemman eluoitumiskäyttäytymisen (Mant et al., 2007).
Yksittäinen prosenttiluku ilman asiayhteyttä on vähäarvoinen, koska se on menetelmäriippuvainen. Sama näyte voi tuottaa kahdella eri kolonnilla tai kahdella ilmaisuaaltopituudella hieman erilaisia arvoja, koska sivukomponenttien erottuminen ja UV-absorptio vaihtelevat. Vain yhdellä aaltopituudella mitattu 99%:n puhtaus vakuuttaa vasta sitten, kun menetelmä on dokumentoitu täydellisesti ja siihen liittyvä kromatogrammi on liitetty mukaan. Pelkkää lukua ilman spektriä ei voi tarkistaa.
Tähän lisäksi tulee, että HPLC-puhtaus ei rekisteröi UV-inaktiivisia ainesosia. Synteesi- ja puhdistusprosessista peräisin olevat suolat, kuten asetaatti- tai trifluoroasetaatti-vastaionit, sekä jäännösvesi tuovat massaa esiintymättä kromatogrammissa. Siksi netto-peptidipitoisuus, joka usein määritetään aminohappoanalyysillä tai typpimäärityksellä, on järkevä täydennys: se kertoo, kuinka paljon puhdasta peptidiä jauhemilligrammaa kohti todellisuudessa on. Identiteetti (MS), suhteellinen puhtaus (HPLC) ja absoluuttinen pitoisuus ovat kolme erilaista kysymystä, joihin hyvä CoA vastaa erikseen.
Jokainen synteesisarja on oma kemiallinen prosessinsa omine vaihteluineen, minkä vuoksi CoA:n on aina liityttävä tiettyyn valmistuserään. Yleinen tietolehtinen, jonka pitäisi päteä kaikkiin koskaan valmistettuihin tuotteen yksiköihin, ei ole testaustodiste vaan mainoslause. Vasta asiakirjan eränumero kytkee mitatut arvot edessäsi olevassa pullossa olevaan fyysiseen materiaaliin. Retentioaika, massaspektri ja puhtaus pätevät täsmälleen tähän tuotantoyksikköön.
Tämä on merkityksellistä myös siksi, että epäpuhtausprofiili voi vaihdella erien välillä. Yksi erä saavuttaa ehkä 99,2%, toinen 98,6% hieman erilaisella sivuhuippukuviolla. Vain erään sidottu CoA kuvaa tämän todellisuuden. Käytännössä sinun tulisi verrata etikettiin merkittyä eränumeroa CoA:han merkittyyn, tarkistaa testauspäivämäärä ja varmistaa, että kromatogrammi todella on mukana. Jos eräviittaus tai alkuperäinen tietolehtinen puuttuu, puhtaustietoa ei voi todentaa, riippumatta siitä, kuinka korkea luku on.
Päähuipun vieressä olevat pienet huiput eivät ole sattumaa, vaan niillä on määritellyt kemialliset syyt. Kiinteäfaasisynteesistä ovat peräisin ennen kaikkea deleetiopeptidit, joissa rakentamisen aikana on jätetty pois yksi aminohappo, sekä lyhentyneet sekvenssit ennenaikaisen ketjun katkeamisen vuoksi. Tämän ohella esiintyy tuotteita epätäydellisestä suojaryhmien poistosta, joissa suojaryhmiä jää molekyyliin, sekä rasemisaatiotuotteita muuttuneine stereokemioineen. Nämä lähisukulaiset eroavat usein vain hyvin vähän kohdepeptidistä ja eluoituvat vastaavasti lähellä päähuippua.
Säilytyksen jälkeen voi tulla mukaan lisää hajoamistuotteita. Katsauksen Lai & Topp, 1999 mukaan deamidaatio, peptidisidoksen katkeaminen, hapettuminen, Maillard-reaktio, beeta-eliminaatio ja aggregaatio lukeutuvat tärkeimpiin kemiallisiin reaktioihin kiinteässä tilassa. Kromatogrammissa tällaiset prosessit ilmenevät uusina tai kasvavina sivuhuippuina. Heti synteesin jälkeen laadittu CoA dokumentoi siksi lähtötilan; todellinen profiili tutkimuslaboratoriossa riippuu lisäksi käsittelystä ja säilytyksestä.
CoA:han dokumentoitu puhtaus pätee mittaushetkellä, useimmiten suoraan synteesin ja puhdistuksen jälkeen. Tutkimuspeptidit toimitetaankin lähes aina lyofilisaattina, eli pakkaskuivattuna jauheena, koska veden poistaminen hidastaa voimakkaasti hydrolyyttisiä ja hapettavia hajoamisreittejä. Lähteen Lai & Topp, 1999 mukaan kemiallista stabiilisuutta kiinteässä tilassa määräävät olennaisesti lämpötila, jäännöskosteus ja olomuoto; jo vähäinen jäännöskosteus voi nopeuttaa aggregaatiota.
Tämä tarkoittaa käytännössä: kaunein 99%:n merkintä hyödyttää vähän, jos materiaalia säilytetään tämän jälkeen asiattomasti. Suljetun lyofilisaatin viileä, kuiva ja valolta suojattu säilytys ylläpitää CoA:han dokumentoitua profiilia pisimpään. Kun peptidi rekonstituoidaan, eli saatetaan liuokseen, vedestä riippuvat hajoamisreaktiot alkavat tapahtua nopeammin, ja alkuperäinen kromatogrammi menettää pätevyytensä. Jos haluaa tulkita puhtaustietoja oikein, on siksi pidettävä mittaus- ja käyttöajankohta erillään: CoA kuvaa toimitustilan, ei pysyvää tilaa koko käyttöajan ajalta.
Järjestelmällinen tarkistus kestää vain muutaman minuutin ja tekee abstrakteista arvoista käsin kosketeltavia. Käy asiakirja läpi tässä järjestyksessä:
Jos jokin näistä kohdista puuttuu, CoA on epätäydellinen. Erityisen kriittistä on alkuperäisten grafiikoiden puuttuminen: ilman kromatogrammia ja spektriä puhtausluku jää pelkäksi väittämäksi. Täydellinen, erään sidottu asiakirja kaikkine raakatietoineen on sen sijaan vahvin laatusignaali, jonka tutkimuspeptidi voi tuoda mukanaan. Se sallii sinun todentaa väittämät itse sen sijaan, että luottaisit yksittäiseen lukuun.
HPLC-puhtaus on suhteellinen pinta-alatieto ja kertoo, mikä osuus UV-aktiivisista ainesosista kohdistuu kohdepeptidiin. Peptidipitoisuus sen sijaan ilmaisee, kuinka paljon puhdasta peptidiä on kokonaisjauheen milligrammaa kohti, ja ottaa huomioon myös UV-inaktiiviset ainesosat kuten suolat ja jäännösveden. Molemmat arvot täydentävät toisiaan, ja niitä tulisi tarkastella erikseen.
Ei automaattisesti, sillä luku on menetelmäriippuvainen. Dokumentoitu kromatogrammi arvolla 98% voi olla informatiivisempi kuin pelkkä 99%:n merkintä ilman alkuperäisiä tietoja. Ratkaisevaa on, että puhtaus on todistettu todennettavalla, eräkohtaisella kromatogrammilla ja että mittausmenetelmä on ilmoitettu selvästi.
HPLC erottaa vain fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan ja näyttää erottumiskäyttäytymisen, ei molekyylirakennetta. Kaksi eri molekyyliä voisi teoriassa eluoitua samankaltaisesti. Vasta massaspektrometria mittaa molekyylipainon ja varmistaa teoreettiseen arvoon vertaamalla, että kyseessä todella on kohdepeptidi.
CoA dokumentoi tilan testaushetkellä, useimmiten suoraan synteesin jälkeen. Se pysyy pätevänä alkuperätodisteena, mutta ei kuvaa tilaa pitkän tai asiattoman säilytyksen jälkeen. Kiinnitä huomiota ilmoitettuun testauspäivämäärään ja ota huomioon, että todellinen puhtaus riippuu säilytysolosuhteista.
Vain tutkimuskäyttöön. Ei tarkoitettu ihmisen nautittavaksi. Tieteellinen toimitus: Dr. Sieglinde Klaus
