Peptidien rekonstituointi: vaiheittainen ohje
Dr. Sieglinde Klaus
Tieteellinen toimitus · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Tieteellinen toimitus · Bergdorf Bioscience
Rekonstituointi tarkoittaa lyofilisoidun (kylmäkuivatun) tutkimuspeptidin hallittua liuottamista sopivaan liuottimeen, yleensä bakteriostaattiseen veteen. Laboratoriossa kuivaan aineeseen lisätään tarkasti määritelty määrä nestettä, jolloin syntyy kirkas liuos, jonka pitoisuus (mg per ml) on tunnettu. Puhdas ja steriili työskentely on tässä ratkaisevaa, jotta vältetään kontaminaatio ja vaikuttavan aineen hajoaminen.
Tutkimuspeptidit toimitetaan valkoisena, kuohkeana jauheena, koska kylmäkuivaus poistaa aineesta veden alipaineessa ja jättää jäljelle amorfisen, säilytyksessä vakaan jauheen. Tässä kuivassa tilassa tyypilliset kemialliset hajoamisreitit kuten hydrolyysi, deamidaatio ja hapettuminen etenevät selvästi hitaammin kuin vesiliuoksessa (Manning et al., 2010). Rekonstituointi muuntaa tämän jauheen takaisin liuokseksi, jota tarvitaan jatkokäsittelyä varten laboratoriossa. Heti kun vettä lisätään, kemiallinen kello alkaa kuitenkin käydä: liuoksessa olevat peptidit ovat lähtökohtaisesti vähemmän vakaita kuin lyofilisoidussa lähtötilassaan. Toimenpiteen tavoitteena on siksi toistettavissa oleva, dokumentoitu pitoisuus, samalla kun mikrobiologinen ja mekaaninen kuormitus pidetään mahdollisimman pienenä. Tyypilliset määrät ovat 1 - 10 mg peptidiä injektiopulloa (vial) kohti, ja ne liuotetaan 1 - 5 ml:aan liuotinta. Tilavuuden valinta määrää suoraan lopullisen pitoisuuden, ja se tulisi päättää ennen ensimmäistäkään työvaihetta. Kun tavoitepitoisuus suunnitellaan etukäteen, vältetään myöhempi jälkilaimentaminen, joka tuo mukanaan lisää pipetointivaiheita ja siten lisää virhelähteitä. Nämä vaiheet on ymmärrettävä yksinomaan tutkimusmateriaalin laboratoriokäsittelynä.
Puhdasta rekonstituointia varten laboratoriossa on hyödyllistä laatia lyhyt, täydellinen tarvikeluettelo, jottei työnkulku katkea. Seuraavat tavarat kuuluvat työtasolle:
Ohut neulan koko 29 - 31 G pienentää pistokohdan kokoa kumiseptumissa ja siten kontaminaation ja tilavuushävikin riskiä. Bakteriostaattinen vesi on tässä suositeltava liuotin, koska se sisältää 0,9 prosenttia (9 mg per ml) bentsyylialkoholia bakteriostaattisena säilöntäaineena ja estää siten liuoksessa tapahtuvaa mikrobien lisääntymistä (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Jos varastosi on lopussa, voit tilata bakteriostaattista vettä. Jos et ole vielä perehtynyt tämän aineluokan perusteisiin, oppaasta Mitä peptidit ovat? löydät taustatietoa.
Keskeinen kaava on hyvin yksinkertainen: pitoisuus saadaan jakamalla peptidimäärä lisätyllä vesitilavuudella, eli pitoisuus (mg per ml) on yhtä kuin mg peptidiä jaettuna ml:lla vettä. Injektiopullo, jossa on 5 mg peptidiä ja joka liuotetaan 2 ml:aan bakteriostaattista vettä, antaa siten 2,5 mg per ml. Jos sen sijaan lisätään 5 ml, pitoisuus laskee 1 mg:aan per ml. Haluttu pitoisuus riippuu siitä, kuinka hienojakoinen myöhemmän määrän mittauksen tulee olla: alhaisempi pitoisuus merkitsee suurempia mitattavia tilavuuksia ja siten pienempää suhteellista pipetointiepätarkkuutta. Koska insuliiniruiskut on usein asteikoitu yksiköissä (100 yksikköä on yhtä kuin 1 ml), kannattaa valita pitoisuus siten, että tarvittavat määrät osuvat luettaville yksikkömerkinnöille. Käytännön esimerkki: pitoisuudella 2 mg per ml 10 yksikköä insuliiniruiskulla vastaa tarkalleen 0,1 ml:aa ja siten 0,2 mg:aa peptidiä. Laskuvirheiden välttämiseksi ja eri tilavuusskenaarioiden läpikäymiseksi digitaalinen apuväline on järkevä. Peptidilaskuri hoitaa muunnoksen peptidimäärän, vesitilavuuden ja ruiskun asteikon välillä ja vähentää siten laimennusvirheiden riskiä. Merkitse laskettu pitoisuus suoraan injektiopulloon, jotta jokainen myöhempi otto pysyy jäljitettävissä.
Varsinainen liuotusprosessi noudattaa kiinteää järjestystä, joka suojaa sekä steriiliyttä että peptidin eheyttä. Toimi seuraavasti:
Veden ohjaaminen lasin seinää pitkin ei ole kosmeettinen vaihe, vaan se vähentää mekaanista leikkauskuormitusta ja vaahtoamista, joka edistää aggregaatiota ilma-vesi-rajapinnoilla (Zapadka et al., 2017). Voimakas, suora vesisuihku voi synnyttää paikallisesti suuria leikkausvoimia ja denaturoida peptidiä osittain. Kärsivällisyys on tässä tärkeämpää kuin nopeus. Nämä ohjeet koskevat yksinomaan tutkimusmateriaalin käsittelyä laboratoriossa.
Veden lisäämisen jälkeen injektiopullon pohjalle tai seinään jää usein liukenematonta materiaalia. Houkutus ravistaa voimakkaasti on suuri, mutta juuri se on haitallista. Mekaaninen kuormitus kuten ravistaminen, sekoittaminen tai vortexointi on tutkimuksessa vakiintunut keino kiihdyttää tarkoituksellisesti peptidien ja proteiinien aggregaatiota (Zapadka et al., 2017). Ravistaminen synnyttää lukemattomia pieniä ilmakuplia ja siten valtavasti suurentuneen ilma-vesi-rajapinnan; tämä hydrofobinen rajapinta edistää peptidimolekyylien aukeamista ja kasaantumista. Ravistamisen sijaan injektiopulloa tulisi pyörittää varovasti peukalon ja etusormen välissä tai keinuttaa hitain kiertoliikkein. Hyvin liukenevien peptidien kohdalla riittää usein, että injektiopullon antaa veden lisäyksen jälkeen levätä muutaman minuutin; jauhe liukenee silloin itsestään. Jos jäännös ei liukene, auttaa varovainen pyörittäminen uudelleen väliajoin, mutta ei koskaan ravistaminen. Valmiin liuoksen tulisi olla kirkas ja vapaa näkyvistä hiukkasista, samentumista tai vaahdosta. Jos se näyttää sameelta tai siihen muodostuu hiutaleita, se viittaa alkavaan aggregaatioon tai epätäydelliseen liukenemiseen, ja näyte tulisi arvioida kriittisesti. Hellävarainen käsittely ei siten ole yksityiskohta, vaan suora suojatoimenpide molekyylin eheydelle.
Liukenemisaika riippuu vahvasti aminohapposekvenssistä, peptidimäärästä ja valitusta pitoisuudesta. Hyvin vesiliukoiset, hydrofiiliset peptidit liukenevat usein muutamassa minuutissa täysin huoneenlämmössä, kun vesi on lisätty seinää pitkin ja injektiopulloa keinutetaan hellävaraisesti. Sekvenssit, joissa on suuri osuus hydrofobisia aminohappoja kuten leusiinia, valiinia, fenyylialaniinia tai tryptofaania, liukenevat hitaammin ja vaativat joskus 15 - 30 minuuttia tai toistuvaa hellävaraista keinuttamista muutaman minuutin välein. Tärkeää on antaa prosessille aikaa sen sijaan, että sitä yrittäisi vauhdittaa mekaanisella voimalla. Liukenemisen nopeuttaminen lämmittämällä ei ole suositeltavaa, koska kohonnut lämpötila edistää useita hajoamisreittejä samanaikaisesti: deamidaatio ja hydrolyysi kiihtyvät lämpötilan noustessa, ja myös fyysinen aggregaatio osoittaa selvää lämpötilariippuvuutta (Manning et al., 2010). Jos 30 minuutin ja useiden keinutusvälien jälkeen jää näkyvästi liukenematonta materiaalia, tilavuutta voidaan hieman lisätä pitoisuuden laskemiseksi, tai näyte dokumentoidaan epätäydellisesti liuenneeksi. Täysin rekonstituoitu liuos on optisesti kirkas; jokainen pysyvä samentuma tulisi ymmärtää varoitusmerkiksi. Suunnittele liukenemiselle aikapuskuri kokeen kulkuun alusta alkaen.
Heti kun peptidi on liuoksessa, sen vakaus laskee selvästi, ja säilytysolosuhteista tulee ratkaiseva tekijä. Rekonstituoitua liuosta tulisi säilyttää viileässä, pimeässä ja hyvin suljettuna, yleensä jääkaapissa 2 - 8 celsiusasteessa. Bakteriostaattisen veden sisältämä bentsyylialkoholi estää bakteerien kasvua ja pidentää siten avatun liuoksen käyttökelpoista aikaa, mutta ei korvaa puhdasta työskentelytapaa (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Pidempiaikaiseen säilytykseen jäädyttäminen on vaihtoehto, mutta yhdellä tärkeällä rajoituksella: jokainen jäädytys-sulatus-sykli kuormittaa peptidiä mekaanisesti ja kemiallisesti. Proteiiniliuoksilla tehdyt tutkimukset osoittavat, että jokainen ylimääräinen jäädytys-sulatus-sykli lisää hiukkasten määrää ja siten aggregaattien muodostumista näytteessä (Hauptmann et al., 2018). Käytännön seuraus kuuluu: jaa liuos ennen jäädyttämistä pieniin kertakäyttöisiin annoksiin (alikvootteihin), niin että jokaista käyttöä varten sulatetaan vain yksi alikvootti ja toistuva jäädyttäminen jää pois. Suojaa injektiopullot lisäksi valolta ja merkitse jokaiseen pitoisuus ja päivämäärä. Sulattamisessa suositellaan hidasta lämmitystä jääkaapissa lämpimän vesihauteen sijaan, jotta vältetään lämpöshokit. Kun näitä sääntöjä noudattaa, hajoaminen pysyy käyttöajan kuluessa vähäisenä.
Kontaminaatiosuoja ei ala vasta pistettäessä, vaan jo työtason valmistelussa. Puhdista työpiste, aseta kaikki tarvikkeet käden ulottuville ja desinfioi jokainen kumiseptum ennen jokaista yksittäistä pistoa tuoreella alkoholipyyhkeellä (70-prosenttinen isopropanoli), jonka annat kuivua hetken. Käytä jokaiseen ottoon steriiliä neulaa ja vältä saman neulan viemistä toistuvasti eri septumien läpi, koska se voi levittää mikrobeja. Älä koskaan kosketa neulan kärkeä tai ruiskun kartiota sormilla. Säilöntäaine bentsyylialkoholi tosin estää bakteerien kasvua, mutta tämä suoja on rajallinen eikä ole vapaakirja epäpuhtaalle työskentelylle; bakteriostaattinen vaikutus ei tapa olemassa olevia mikrobeja, vaan viivyttää vain niiden lisääntymistä (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Lisäksi on huomattava, että bentsyylialkoholi ei ole vaaratonta: historiallisesti se yhdistettiin keskosilla niin sanottuun gasping-oireyhtymään, joka on vakava toksinen reaktio korkeasta bentsyylialkoholialtistuksesta (Gershanik et al., 1982). Tämä korostaa, että bakteriostaattinen vesi on laboratorioreagenssi, jolla on oma turvallisuusprofiilinsa, ja sitä käytetään yksinomaan tutkimusmateriaalin käsittelyyn. Dokumentoi jokainen otto, jotta näytteen eheys pysyy jäljitettävissä koko sen käyttöajan.
Monet rekonstituoinnin ongelmat johtuvat pienestä joukosta toistuvia virheitä, jotka voidaan välttää pienellä tarkkaavaisuudella. Yleisimmät ovat:
Kun nämä kohdat käy systemaattisesti läpi, saa toistettavasti kirkkaita liuoksia, joiden pitoisuus on dokumentoitu. Lyhyt tarkistuslista työtasolla auttaa, ettei yhtäkään vaihetta jätetä väliin, etenkin kun useita injektiopulloja käsitellään sarjassa. Oikean määrälaskennan, hellävaraisen käsittelyn ja johdonmukaisen steriiliyden yhdistelmä muodostaa perustan jokaiselle puhtaalle tutkimuspeptidien laboratoriokäsittelylle.
Laboratoriossa käytetään yleensä bakteriostaattista vettä, koska sen 0,9 prosentin bentsyylialkoholipitoisuus estää mikrobien lisääntymistä avatussa liuoksessa. Joillekin hydrofobisille tai vaikealiukoisille sekvensseille voi olla tarpeen käyttää poikkeavia liuottimia. Valinnan tulisi aina perustua kyseisen peptidin liukoisuusprofiiliin.
Pitoisuus saadaan jakamalla mg peptidiä ml:lla vettä. 5 mg:n injektiopullo, jossa on 2 ml vettä, antaa 2,5 mg per ml. Peptidilaskuri hoitaa tämän muunnoksen insuliiniruiskun asteikko mukaan lukien ja vähentää laskuvirheitä.
Ravistaminen synnyttää paljon ilmakuplia ja suurentaa ilma-vesi-rajapintaa, jolla peptidit aggregoituvat helpommin. Hellävarainen pyörittäminen tai keinuttaminen liuottaa jauheen yhtä lailla, mutta suojaa molekyylirakennetta. Mekaanista kuormitusta käytetään tutkimuksissa jopa tarkoituksella aggregaation kiihdyttämiseen.
Liuoksessa peptidit ovat selvästi vähemmän vakaita kuin jauheena. Jäähdytetty liuos (2 - 8 celsiusastetta) tulisi käyttää ripeästi; pidempää säilytystä varten se jäädytetään kertakäyttöisinä alikvootteina toistuvien jäädytys-sulatus-syklien välttämiseksi. Tarkka profiili riippuu sekvenssistä.
Vain tutkimuskäyttöön. Ei tarkoitettu ihmisen nautittavaksi. Tieteellinen toimitus: Dr. Sieglinde Klaus
