Thymosin Alpha-1: tymuksen immuunipeptidi tutkimuskatsauksessa
Dr. Sieglinde Klaus
Tieteellinen toimitus · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Tieteellinen toimitus · Bergdorf Bioscience
Thymosin Alpha-1 (Tα1, INN: Thymalfasin) on 28 aminohapon pituinen, N-terminaalisesti asetyloitu peptidi, joka on peräisin tymuksesta ja jota tutkitaan immunomoduloivana peptidinä ja biologisena vasteenmuokkaajana. Se eristettiin alun perin vasikan tymuksesta ja sen sekvenssi määritettiin (Goldstein et al., 1977). Synteettinen lääkemuoto kantaa kauppanimeä Zadaxin.
Thymosin Alpha-1 on tymuksen polypeptidi, jonka Goldstein ja kollegat eristivät vasikan tymuksesta vuonna 1977 ja jonka he sekvensoivat täydellisesti (Goldstein et al., 1977). Aine koostuu 28 aminohappojäännöksestä ja kuuluu immunomoduloivien peptidien luokkaan, jotka immunologiassa luokitellaan biologisiksi vasteenmuokkaajiksi. Ominaista on N-terminaalinen asetylaatio: päätteinen seriini kantaa asetyyliryhmää, joka lisää noin 42 Da molekyylimassaan ja erottaa kypsen muodon ei-asetyloidusta esiasteesta (Liu et al., 2013).
Synteettinen, farmaseuttisesti standardoitu muoto kantaa kansainvälistä yleisnimitystä Thymalfasin ja sitä myödään kauppanimellä Zadaxin. Historiallisessa tarkastelussa Tα1 kuvataan yhtenä pisimpään tutkituista tymuspeptideistä, jonka tutkimus ulottuu usean vuosikymmenen ajalle (Camerini & Garaci, 2015). Tα1 on lämpöstabiili, voimakkaasti hapan molekyyli, jonka fysikokemialliset ominaisuudet dokumentoitiin jo ensikuvauksessa (Goldstein et al., 1977).
Tärkeää luokittelun kannalta: Thymosin Alpha-1 ei ole kudoskorjaus- tai angiogeneesipeptidi, vaan sitä tarkastellaan tutkimuksessa ensisijaisesti synnynnäisen ja hankitun immuniteetin rajapinnan moduloijana (Dominari et al., 2020).
Thymosin Alpha-1:n aminohapposekvenssi käsittää 28 jäännöstä ja on yhden kirjaimen koodissa Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN, eli asetyloitu seriini N-terminaalissa, jota seuraa täydellinen ketju päätteiseen asparagiiniin saakka (Goldstein et al., 1977). Huomionarvoista on happamien aminohappojen, kuten aspartaatin ja glutamaatin, suuri osuus, joka antaa molekyylille sen voimakkaasti happaman luonteen.
Kypsen, N-asetyloidun muodon molekyylimassa on noin 3108-3109 Da; massaspektrometrinen karakterisointi antaa arvon 3108,79 Da (Liu et al., 2013). Ei-asetyloidulla variantilla on noin 3065 Da:n pienempi massa; asetyyliryhmä lisää mainitut noin 42 Da. Tämä N-terminaalinen asetylaatio on saatavilla olevan kirjallisuuden mukaan rakenteellisesti merkittävä täyden biologisen aktiivisuuden kannalta ja parantaa samalla stabiilisuutta aminopeptidaasien aiheuttamaa hajoamista vastaan, sillä asetylaatio pidentää puoliintumisaikaa vapaaseen amino-muotoon verrattuna (Liu et al., 2013).
Laboratoriokäytännön kannalta tämä tarkoittaa, että puhtaus ja oikea asetylaatio ovat ratkaisevia laatuominaisuuksia. Tutkijoiden tulisi tarkistaa eräkohtaiset analyysitodistukset, jotka tyypillisesti osoittavat 98 prosentin tai sitä korkeammat puhtausasteet sekä N-terminaalisen asetylaation vahvistuksen. Molekyylin lämpöstabiilius nostettiin jo ensikuvauksessa esiin huomionarvoisena ominaisuutena (Goldstein et al., 1977).
Thymosin Alpha-1 kuvataan tutkimuksessa pleiotrooppisena immunomoduloijana, joka vaikuttaa ensisijaisesti synnynnäisen ja hankitun immuniteetin rajapinnassa (Romani et al., 2007). Keskeinen vaikutusmekanismi kulkee Toll-like-reseptorien kautta: tutkimukset viittaavat siihen, että Tα1 signaloi TLR2:n kautta myeloidisissa dendriittisoluissa ja TLR9:n kautta plasmasytoidisissa dendriittisoluissa, ja nimenomaan MyD88-riippuvaisen signaalireitin kautta, joka aktivoi IRF7:n ja johtaa interferonin efektorireittiin (IFN-α ja IFN-γ) (Dominari et al., 2020).
Solutasolla Tα1 edistää kirjallisuuden mukaan dendriittisolujen kypsymistä ja erilaistumista ja suosii Th1-polarisaatiota. Tämän myötä T-solujen (CD4+ ja CD8+) sekä NK-solujen toiminta voimistuu, ja se voi nostaa alentuneita solumääriä takaisin immuunipuutteisissa tiloissa (Dominari et al., 2020). Samalla stimuloituvat sytokiinit kuten IFN-γ ja IL-2.
Erityisen mielenkiintoinen näkökohta on kaksoissäätely: Tα1 indusoi dendriittisoluissa indoliamiini-2,3-dioksigenaasin (IDO) ja siten tryptofaanin kataboliaa, jolloin syntyy säätelevä miljöö, joka tasapainottaa tulehdusta ja toleranssia (Romani et al., 2007). Tutkimuksessa Tα1 kuvataan siksi tulehduksen, immuniteetin ja toleranssin endogeenisena säätelijänä, joka voimistaa tehokkaita immuunivasteita ja voi samalla vaimentaa yliaktivaatiota.
Saatavilla olevassa kliinisessä ja farmakologisessa kirjallisuudessa vakioannostus on hyvin dokumentoitu. Vakiintunut malli on 1,6 mg ihonalaisesti kahdesti viikossa, mikä vastaa likimäärin 900 µg neliömetriä ihopinta-alaa kohti; käyttö ulottui tutkimuksissa tyypillisesti kuudesta kahteentoista kuukauteen (Dominari et al., 2020). Pediatrisille tai alle 40 kg painaville tutkimukseen osallistuneille kirjallisuudessa kuvataan painoon mukautettu annos 40 µg kilogrammaa kohti.
Muodolliset farmakokineettiset tutkimukset annostelivat myös ihopinta-alan perusteella 900 µg/m² (Rost et al., 1999). Korkeampien annosten siedettävyydestä on saatavilla tietoja, jotka eivät osoittaneet haittavaikutuksia ihmisillä tehdyissä tutkimuksissa järjestelmässä, jossa annosteltiin jopa 16 mg kahdesti viikossa neljän viikon ajan (Rost et al., 1999).
Injektiopullokokojen, käyttökuntoon saattamisen tilavuuden ja niistä seuraavien injektiomäärien laskennallista suunnittelua varten peptidi voidaan mallintaa Bergdorf-työkalussa: Laske Thymosin Alpha-1 peptidilaskurissa. Näin voidaan esimerkiksi seurata, kuinka 1,6 mg:n injektiopullosta saadaan 1 ml:n käyttökuntoon saattamisen tilavuudella konsentraatio 1,6 mg/ml ja mikä insuliiniruiskun asteikkomerkintä vastaa 1,6 mg:n annosta. Kaikki mainitut arvot ovat peräisin yksinomaan tutkimus- ja ammattitietokirjallisuudesta eikä niitä tule käsittää käyttösuosituksena ihmisellä.
Ihonalaisen injektion jälkeen Thymosin Alpha-1 imeytyy nopeasti ja lähes täydellisesti, mikä viittaa korkeaan biologiseen hyödynnettävyyteen (Rost et al., 1999). Maksimaalinen plasmapitoisuus (Tmax) saavutetaan noin yhdestä kahteen tuntia injektion jälkeen. Huippupitoisuudet (Cmax) olivat 900 µg/m²:n annostuksella noin 30-80 µg/L:n alueella (Rost et al., 1999).
Jakautumistilavuus ilmoitetaan noin 5-8 L:ksi, mikä vastaa solunulkoista tilaa; pienenä, voimakkaasti happamana peptidinä Tα1 sitoutuu plasman proteiineihin vähän. Eliminaatio tapahtuu proteolyyttisen hajoamisen kautta kudoksessa sijaitsevien ja kiertelevien aminopeptidaasien välityksellä, jolloin munuaisten kautta tapahtuva takaisinsaanti on 31-60 prosenttia annoksesta (Rost et al., 1999). Terminaalinen plasman puoliintumisaika on Thymalfasinin valmisteyhteenvedon mukaan noin 2 tuntia; kolmea ihonalaista formulaatiota koskeva muodollinen farmakokineettinen tutkimus raportoi eliminaation puoliintumisajaksi alle 3 tuntia (Rost et al., 1999).
Huomionarvoista on, että seerumin pitoisuudet palaavat lähtöarvoon 24 tunnin kuluessa eikä toistuvassa annostelussa tapahdu kertymistä (Rost et al., 1999). Juuri tämän lyhyen puoliintumisajan vuoksi kehitettiin puoliintumisaikaa pidentäviä fuusiovariantteja, jotta natiivin peptidin muutoin lyhyttä viipymäaikaa saataisiin pidennettyä (Camerini & Garaci, 2015).
Terminaalinen plasman puoliintumisaika, noin 2 tuntia, on kirjallisuuteen perustuva ja sitä tukevat sekä Thymalfasinin valmisteyhteenveto että itsenäisesti muodollinen farmakokineettinen tutkimus, joka määritti eliminaation puoliintumisajaksi alle 3 tuntia Tmaxin ollessa yhdestä kahteen tuntia (Rost et al., 1999). Tämä verrattain lyhyt systeeminen viipymäaika selittää kaksi keskeistä kirjallisuudesta tehtyä havaintoa: kertymisen puuttumisen toistuvassa annostelussa ja seerumin pitoisuuksien palautumisen lähtöarvoon 24 tunnin kuluessa.
Tutkimusasetelman kannalta tällä on konkreettisia seurauksia. Tutkimuksessa tavanomainen kahdesti viikossa annettavan ihonalaisen annoksen malli on silmiinpistävässä ristiriidassa lyhyen plasman puoliintumisajan kanssa. Tämä viittaa siihen, että Tα1:n biologinen vaikutus ei ole ensisijaisesti sidoksissa jatkuviin plasmapitoisuuksiin vaan sitä seuraaviin immunologisiin vaikutuksiin, kuten aiheutettuun dendriittisolujen kypsymiseen ja Th1-polarisaatioon, joita aineelle attribuoidaan (Romani et al., 2007).
Juuri tämä havainto on motivoinut puoliintumisaikaa pidentävien rakenteiden, kuten Tα1-Fc-fuusioproteiinien kehittämistä, jotka rakennettiin kohdennetusti siksi, että natiivin Tα1:n puoliintumisaika on lyhyt (Camerini & Garaci, 2015). Jos haluaa seurata eliminaatioprofiilia laskennallisesti, noin 2 tunnin puoliintumisaikaa voi käyttää lähtösuureena puhdistumatarkasteluille.
Kaupallinen, kylmäkuivattu Thymalfasin toimitetaan jauheena käyttökuntoon saattamista varten. Tuotetietojen mukaan markkinoitu valmiste säilytetään jäähdytettynä 2-8 °C:ssa; käyttökuntoon saattaminen tehdään mukana toimitetulla steriilillä vedellä tai laimennusaineella välittömästi ennen ihonalaista injektiota. Nämä säilytystiedot ovat peräisin valmisteyhteenvedosta, ja tutkijoiden tulisi aina noudattaa eräkohtaisia analyysitodistuksia.
Mielenkiintoinen on näennäinen ristiriita molekyylin sisäsyntyisen lämpöstabiiliuden ja valmiin lääkkeen kylmäsäilytysvaatimuksen välillä. Peptidi itse on luonnostaan lämpöstabiili ja voimakkaasti hapan, kuten jo ensikarakterisoinnissa dokumentoitiin (Goldstein et al., 1977). Kylmäkuivattuna lääkevalmisteena se kuitenkin säilytetään 2-8 °C:ssa, mikä johtuu koko formulaation stabiiliudesta eikä yksin aminohappoketjun kemiallisesta kestosta.
Laboratoriokäytännön osalta tästä voidaan johtaa selkeät periaatteet: kylmäkuivattu jauhe kuuluu jääkaappiin 2-8 °C:een; käyttökuntoon saattamisen jälkeen liuos tulisi käyttää pian. N-terminaalinen asetylaatio myötävaikuttaa stabiilisuuteen aminopeptidaaseja vastaan ja lisää ketjun vastustuskykyä entsymaattista hajoamista vastaan (Liu et al., 2013). Konkreettiset säilytyslämpötilat ja käyttöajat tulee tarkistaa kulloisestakin analyysitodistuksesta, sillä ne voivat vaihdella eräkohtaisesti.
Kokoavassa kirjallisuudessa Thymosin Alpha-1:tä pidetään yleisesti erittäin hyvin siedettynä. Yli 2 000 hoidetun potilaan osalta haittakokemukset kuvattiin harvinaisiksi ja lieviksi (Dominari et al., 2020). Raportoidut vaikutukset käsittävät paikallisia reaktioita pistoskohdassa, kuten punoitusta tai epämiellyttävää tunnetta, sekä ohimenevää lihasatrofiaa, polyartralgiaa eli useiden nivelten kipua ja käden turvotusta ihottuman kanssa.
Uskottava selitysmalli suotuisalle siedettävyydelle löytyy farmakokineettisestä profiilista: kertymisen puuttuminen toistuvassa annostelussa ja noin 2 tunnin lyhyt puoliintumisaika myötävaikuttavat kirjallisuuden mukaan siedettävyyteen, koska peptidi ei rikastu elimistöön (Rost et al., 1999). Seerumin pitoisuudet palaavat lähtöarvoon 24 tunnin kuluessa, joten jatkuvaa systeemistä altistusta ei synny.
Siedettävyystiedot koskevat kirjallisuudessa tutkittuja annostuksia ja annosteluskeemoja. Jopa ihmisillä tehdyissä annosnostotutkimuksissa siedettiin jopa 16 mg kahdesti viikossa neljän viikon ajan ilman haittavaikutuksia (Rost et al., 1999). Nämä tiedot palvelevat yksinomaan tieteellistä luokittelua tutkimusyhteydessä eivätkä ne ole kannanotto ihmisellä tapahtuvasta käytöstä valvottujen tutkimusten ulkopuolella.
Yhteisestä nimenosasta huolimatta Thymosin Alpha-1 ja Thymosin Beta-4 kuuluvat eri peptidiperheisiin, joilla on erilaiset sekvenssit, koot ja toiminnot. Tα1 on 28 aminohapon pituinen, N-asetyloitu immunomodulaatiopeptidi, joka vaikuttaa TLR2:n ja TLR9:n sekä dendriittisolujen ja T-solujen signaaliakselin kautta (Dominari et al., 2020). Thymosin Beta-4, josta TB-500 on fragmentti, on sen sijaan 43 aminohapon pituinen, G-aktiinia sitova peptidi, joka ohjaa solutukirangan aktiinidynamiikkaa, solujen migraatiota, angiogeneesiä ja kudoskorjausta. Kohderakenne (Toll-like-reseptorit ja IDO verrattuna aktiiniin) ja tutkittu suuntaus (immuunirestauraatio verrattuna haavan paranemiseen) eroavat perustavanlaatuisesti.
Myös BPC-157 erottuu selvästi: kyseessä on synteettinen, 15 aminohapon pituinen, stabiiliksi mahalaukun pentadekapeptidiksi nimetty molekyyli, joka on johdettu mahanesteen proteiinista. Sen tutkimuksessa käsitellyt ominaisuudet koskevat sytoprotektiota, angiogeneesiä sekä jänteiden, nivelsiteiden ja suoliston regeneraatiota, usein yhteydessä VEGFR2- ja eNOS-reitteihin. Näin BPC-157 on regeneraatio- ja sytoprotektiopeptidi eikä tymuksen immunomodulaatiopeptidi; alkuperä, pituus (15 verrattuna 28 aminohappoon) ja mekanismi poikkeavat selvästi Tα1:stä. Tα1 sen sijaan luokitellaan tulehduksen, immuniteetin ja toleranssin endogeeniseksi säätelijäksi (Romani et al., 2007).
KPV on tripeptidi, joka koostuu kolmesta aminohaposta (lysiini-proliini-valiini) ja vastaa α-MSH-hormonin C-terminaalista osaa. Tutkimuksessa KPV:lle attribuoidaan tulehdusta estävä vaikutus, joka välittyy pääasiassa proinflammatoristen NF-κB- ja sytokiinisignaalien vaimentamisen kautta. Näin KPV toimii tulehdusprosessien alas säätelijänä.
Thymosin Alpha-1 noudattaa vastakkaista ensisijaista suuntausta: 28 aminohapon pituisena peptidinä se voimistaa ja tasapainottaa uudelleen hankittua immuniteettia, erityisesti Th1-primauksen kautta Toll-like-reseptorien ja dendriittisolujen aktivoimisella (Romani et al., 2007). Siinä missä KPV vaimentaa tulehdusta, Tα1 palauttaa immuunireaktiivisuuden ja koordinoi sitä. Myös koko ja kohderakenne eroavat merkittävästi: kolme aminohappoa ja NF-κB-välitteinen mekanismi KPV:n puolella verrattuna 28 aminohappoon ja TLR2/TLR9-akseliin Tα1:n puolella.
Tämä vertailu havainnollistaa, että molempien peptidien yksinkertainen luokittelu immuuniaktiivisten aineiden kategoriaan olisi harhaanjohtavaa. KPV vaimentaa olemassa olevaa yliaktivaatiota, kun taas Tα1 saatavilla olevan kirjallisuuden mukaan tasapainottaa uudelleen heikentyneen tai virheellisesti säädellyn immuunivasteen ja käsittelee efektori-immuniteetin ja toleranssin välistä kaksoistasapainoa IDO-induktion kautta (Dominari et al., 2020).
Ei. Thymosin Alpha-1 ja Thymosin Beta-4 (TB-500:n lähtöpeptidi) jakavat vain nimenosan, mutta kuuluvat eri peptidiperheisiin. Tα1 on 28 aminohapon pituinen immunomodulaatiopeptidi, joka vaikuttaa Toll-like-reseptorien kautta, kun taas Thymosin Beta-4 on 43 aminohapon pituinen, aktiinia sitova peptidi, jolla on yhteys kudoskorjaukseen (Dominari et al., 2020).
Terminaalinen plasman puoliintumisaika on valmisteyhteenvedon mukaan noin 2 tuntia, ja muodollinen farmakokineettinen tutkimus raportoi alle 3 tuntia. Seerumin pitoisuudet palaavat lähtöarvoon 24 tunnin kuluessa, eikä toistuvassa annostelussa tapahdu kertymistä (Rost et al., 1999).
N-terminaalin asetyyliryhmä lisää noin 42 Da massaan ja on kirjallisuuden mukaan rakenteellisesti merkittävä täyden biologisen aktiivisuuden kannalta. Samalla se parantaa stabiilisuutta aminopeptidaasien aiheuttamaa hajoamista vastaan ja pidentää siten puoliintumisaikaa vapaaseen amino-muotoon verrattuna (Liu et al., 2013).
Kylmäkuivattu valmis lääke säilytetään tuotetietojen mukaan jäähdytettynä 2-8 °C:ssa ja saatetaan käyttökuntoon välittömästi ennen käyttöä. Peptidi itse on sisäsyntyisesti lämpöstabiili (Goldstein et al., 1977), jäähdytys koskee koko formulaation stabiiliutta; eräkohtaiset ohjeet tulee tarkistaa analyysitodistuksesta.
Kirjallisuudessa vakiintunut malli on 1,6 mg ihonalaisesti kahdesti viikossa, mikä vastaa noin 900 µg neliömetriä ihopinta-alaa kohti (Dominari et al., 2020). Alle 40 kg painaville tutkimukseen osallistuneille kuvataan painoon mukautettu annos 40 µg kilogrammaa kohti. Nämä tiedot palvelevat yksinomaan tutkimustarkoituksia.
Vain tutkimustarkoituksiin. Ei tarkoitettu ihmisen nautittavaksi. Tieteellinen toimitus: Dr. Sieglinde Klaus