Lese HPLC-renhet og CoA for peptider riktig
Dr. Sieglinde Klaus
Vitenskapelig redaksjon · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Vitenskapelig redaksjon · Bergdorf Bioscience
HPLC-renheten angir hvor stor prosentandel av arealet i et kromatogram som tilfaller målpeptidet, mens Certificate of Analysis (CoA) dokumenterer denne verdien sammen med identiteten bekreftet ved massespektrometri, batchen og analysemetodene. En verdi på >=99% betyr at bare et svært lite areal i UV-detektorsignalet tilfaller bikomponenter. Denne guiden forklarer hvordan begge opplysningene blir til, og hvordan du kontrollerer dem.
Høytrykksvæskekromatografi (HPLC) separerer en oppløst peptidblanding etter fysikalsk-kjemiske egenskaper og synliggjør dermed hvor mange komponenter en prøve består av. I peptidanalyse dominerer omvendt-fase-HPLC (RP-HPLC) på C18-, C8- eller C4-kolonner, fordi den separerer molekyler etter hydrofobisitet og samtidig gir høy oppløsningsevne. Ifølge metodeoversikten fra Mant et al., 2007 har HPLC i over 25 år vært ansett som den mest allsidige metoden for isolering og renhetsbestemmelse av syntetiske peptider.
Konkret strømmer en mobil fase, oftest en gradient av vann og acetonitril med 0,05 til 0,1% trifluoreddiksyre (TFA), gjennom kolonnen. Hver komponent forlater kolonnen ved et karakteristisk tidspunkt, retensjonstiden, og gir en topp på UV-detektoren (typisk 214 eller 220 nm, der peptidbindingen absorberer). HPLC måler altså ikke identiteten til et stoff, men dets separasjonsatferd og relative mengdeandel. For en uttalelse om identitet trengs en andre metode: massespektrometri.
Prosentangivelsen for HPLC-renheten beskriver arealandelen til hovedtoppen av det samlede arealet til alle detekterte topper. Ved 99% tilfaller dermed 99% av det integrerte UV-signalarealet målpeptidet, og bare 1% tilfaller samtlige bikomponenter til sammen. Det er viktig å merke seg at dette er en relativ arealangivelse, ikke en vektangivelse: restløsemidler, salter eller vann, som knapt absorberer ved 214 nm, inngår ikke i denne verdien. Derfor supplerer seriøse produsenter HPLC-renheten med ytterligere parametere som netto peptidinnhold.
Bikomponentene stammer som regel fra fastfasesyntesen. Ifølge Boysen & Hearn, 2006 oppstår det ved den trinnvise syntesen først og fremst delesjonssekvenser (en manglende aminosyre), forkortede sekvenser samt produkter fra ufullstendig avbeskyttelse eller racemisering. Nettopp disse kjemisk svært like urenhetene er vanskelige å separere ut og avgjør hvor høy den oppnåelige renheten blir. Et sprang fra 95% til 99% betyr derfor at disse beslektede stoffene i stor grad er fjernet. Mer bakgrunn om selve stoffklassen finner du i guiden Hva er peptider?.
Et CoA er analyseprotokollen for en konkret batch og samler resultatene fra alle gjennomførte analyser på ett dokument. Vanligvis oppgir det produktnavnet, summeformelen og den teoretiske molekylvekten, batchnummeret, produksjons- eller analysedatoen samt de anvendte metodene. Kjernen utgjøres av to blokker: identitetsbekreftelsen ved massespektrometri og renhetsbestemmelsen ved HPLC. Ofte er i tillegg utseendebefunnet (hvitt lyofilisat) og vanninnholdet oppgitt.
Det avgjørende er at et pålitelig CoA viser originaldataene og ikke bare påstår et tall. Til dette hører det avbildede HPLC-kromatogrammet med retensjonstid og integrasjonsarealer samt massespekteret med den målte m/z-verdien. Slik kan en fagkyndig person etterprøve uttalelsene i stedet for bare å tro på dem. Metodeangivelsene bør være presise, for eksempel kolonnetype, gradient, deteksjonsbølgelengde og det benyttede ioniseringsforfaringen. Hos BergdorfBio fungerer det batchrelaterte CoA-et som bevis for >=99%-HPLC- og CoA-løftet som nevnes på forsiden. Produkter som BPC-157 eller Retatrutid leveres hver for seg med et slikt dokument til batchen.
Mens HPLC bare viser separasjonsatferden, besvarer massespektrometrien spørsmålet om det er det riktige molekylet som foreligger. I peptidanalyse dominerer elektrospray-ionisering (ESI), en skånsom ioniseringsmetode som overfører molekyler til gassfasen uten fragmentering. Ifølge Banerjee & Mazumdar, 2012 danner ESI flerladede ioner, noe som utvider det målbare m/z-området betydelig og gjør at også store peptider kan bestemmes presist.
På CoA-et stilles den målte molekylvekten opp mot den teoretiske verdien beregnet ut fra summeformelen. Stemmer begge overens på noen få masseenheter, er peptidets identitet bekreftet. Et avvik på for eksempel 18 masseenheter kan tyde på et vanntap, en større differanse på en feil eller forurenset sekvens. Koblingen av begge metoder, altså LC-MS, er særlig informativ: Toll et al., 2005 viste at over 50 peptider fra en tryptisk fordøyelse lot seg separere på 15 til 20 minutter og samtidig identifisere ved ESI-MS. Identitet og renhet registreres dermed i ett enkelt analyseløp.
Kromatogrammet er den grafiske kjerneutsagnet i ethvert CoA: på x-aksen står tiden i minutter, på y-aksen detektorresponsen, oftest i milliabsorbansenheter (mAU). Målpeptidet vises som en høy, smal hovedtopp ved sin karakteristiske retensjonstid, for eksempel ved 8 til 12 minutter avhengig av metoden. En rent utført prøve viser en enkelt, skarp og symmetrisk topp med tydelig basislinjeseparasjon fra eventuelle bitopper.
Når du leser, bør du være oppmerksom på tre ting. For det første toppformen: en sterkt skjev topp (tailing) eller en breddet basis kan tyde på koeluerende urenheter eller kolonneproblemer. For det andre små bitopper: disse representerer biprodukter fra syntesen, og arealsummen deres utgjør den manglende prosentandelen opp til 100%-merket. For det tredje basislinjen: den bør forløpe flatt og rolig, uten drift. Integrasjonen, altså den beregningsmessige arealbestemmelsen under hver topp, gir til slutt prosenttallene. En TFA-holdig mobil fase forbedrer samtidig toppskarpheten, ettersom TFA som ionepar-reagens maskerer peptidets basiske sidekjeder og dermed gir en mer homogen elueringsatferd (Mant et al., 2007).
En enkelt prosentangivelse uten kontekst er lite verdt, fordi den er metodeavhengig. Den samme prøven kan gi litt ulike verdier på to forskjellige kolonner eller ved to deteksjonsbølgelengder, ettersom separasjonen og UV-absorpsjonen til bikomponentene varierer. En renhet på 99%, målt ved bare én bølgelengde, overbeviser først når metoden er fullstendig dokumentert og det tilhørende kromatogrammet er vedlagt. Et nakent tall uten spekter lar seg ikke etterprøve.
I tillegg kommer at HPLC-renheten ikke registrerer UV-inaktive bestanddeler. Salter fra syntese- og rensingsprosessen, for eksempel acetat- eller trifluoracetat-motioner, samt restvann bidrar med masse uten å dukke opp i kromatogrammet. Derfor er netto peptidinnhold, ofte bestemt ved aminosyreanalyse eller nitrogenbestemmelse, et fornuftig supplement: det forteller hvor mye rent peptid som faktisk er innholdt per milligram pulver. Identitet (MS), relativ renhet (HPLC) og absolutt innhold er tre forskjellige spørsmål som et godt CoA besvarer hver for seg.
Hver synteseserie er en egen kjemisk prosess med egne variasjoner, og derfor må et CoA alltid være knyttet til en konkret batch. Et generisk datablad som skal gjelde for alle enheter av et produkt som noensinne er produsert, er ikke et analysebevis, men en reklamepåstand. Først batchnummeret på dokumentet knytter de målte verdiene til det fysiske materialet i flasken foran deg. Retensjonstiden, massespekteret og renheten gjelder nøyaktig for denne produksjonsenheten.
Dette er også relevant fordi urenhetsprofilen kan variere mellom batcher. Én batch oppnår kanskje 99,2%, en annen 98,6% med et litt annet bitoppmønster. Bare et batchbundet CoA gjenspeiler denne virkeligheten. Praktisk bør du sammenligne batchnummeret på etiketten med det på CoA-et, kontrollere analysedatoen og forsikre deg om at kromatogrammet faktisk er vedlagt. Mangler batchtilknytningen eller originaldatabladet, er renhetsangivelsen ikke etterprøvbar, uavhengig av hvor høyt tallet er.
De små toppene ved siden av hovedtoppen er ikke tilfeldige, men har definerte kjemiske årsaker. Fra fastfasesyntesen stammer først og fremst delesjonspeptider, der en aminosyre ble utelatt under oppbyggingen, samt forkortede sekvenser på grunn av for tidlig kjedebrudd. Ved siden av forekommer produkter fra ufullstendig avbeskyttelse, der beskyttelsesgrupper blir værende på molekylet, samt racemiseringsprodukter med endret stereokjemi. Disse beslektede stoffene skiller seg ofte bare minimalt fra målpeptidet og eluerer følgelig tett ved hovedtoppen.
Etter lagring kan ytterligere nedbrytningsprodukter komme til. Ifølge oversikten fra Lai & Topp, 1999 hører deamidering, spalting av peptidbindingen, oksidasjon, Maillard-reaksjonen, beta-eliminering og aggregering til de viktigste kjemiske reaksjonene i fast tilstand. I kromatogrammet kommer slike prosesser til uttrykk som nye eller voksende bitopper. Et CoA opprettet rett etter syntesen dokumenterer derfor utgangstilstanden; den faktiske profilen i forskningslaboratoriet avhenger i tillegg av håndtering og lagring.
Renheten som er dokumentert på CoA-et, gjelder for måletidspunktet, oftest rett etter syntese og opprensing. Forskningspeptider leveres derfor nesten alltid som lyofilisat, altså som frysetørket pulver, fordi fjerningen av vann sterkt forsinker de hydrolytiske og oksidative nedbrytningsveiene. Ifølge Lai & Topp, 1999 bestemmes den kjemiske stabiliteten i fast tilstand i vesentlig grad av temperatur, restfuktighet og aggregattilstand; allerede lav restfuktighet kan akselerere aggregeringen.
Det betyr i praksis: den vakreste 99%-angivelsen nytter lite hvis materialet deretter lagres feilaktig. En kjølig, tørr og lysbeskyttet oppbevaring av det forseglede lyofilisatet bevarer profilen dokumentert på CoA-et lengst. Når et peptid rekonstitueres, altså bringes i løsning, begynner de vannavhengige nedbrytningsreaksjonene å forløpe raskere, og det opprinnelige kromatogrammet mister sin gyldighet. Den som vil tolke renhetsdata korrekt, må derfor holde måle- og bruksdatoen fra hverandre: CoA-et beskriver leveringstilstanden, ikke en varig tilstand gjennom hele brukstiden.
En systematisk kontroll tar bare noen få minutter og gjør de abstrakte verdiene håndgripelige. Gå gjennom dokumentet i denne rekkefølgen:
Mangler ett av disse punktene, er CoA-et ufullstendig. Spesielt kritisk er fraværet av originalgrafikkene: uten kromatogram og spekter forblir renhetstallet en ren påstand. Et fullstendig, batchbundet dokument med alle rådata er derimot det sterkeste kvalitetssignalet et forskningspeptid kan ha med seg. Det lar deg etterprøve uttalelsene selv, i stedet for å stole på et isolert tall.
HPLC-renheten er en relativ arealangivelse og forteller hvilken andel av de UV-aktive bestanddelene som tilfaller målpeptidet. Peptidinnholdet derimot angir hvor mye rent peptid som er innholdt per milligram totalt pulver, og tar også hensyn til UV-inaktive bestanddeler som salter og restvann. Begge verdiene utfyller hverandre og bør betraktes hver for seg.
Ikke automatisk, ettersom tallet er metodeavhengig. Et dokumentert kromatogram ved 98% kan være mer informativt enn en naken 99%-angivelse uten originaldata. Det avgjørende er at renheten er belagt med et etterprøvbart, batchrelatert kromatogram og at målemetoden er klart oppgitt.
HPLC separerer bare etter fysikalsk-kjemiske egenskaper og viser separasjonsatferden, ikke den molekylære sammensetningen. To forskjellige molekyler kunne teoretisk eluere likt. Først massespektrometrien måler molekylvekten og bekrefter ved sammenligning med den teoretiske verdien at det faktisk er målpeptidet som foreligger.
Et CoA dokumenterer tilstanden på analysetidspunktet, oftest rett etter syntese. Det forblir gyldig som opprinnelsesbevis, men beskriver ikke tilstanden etter lang eller feilaktig lagring. Vær oppmerksom på et oppgitt analysedato og ta hensyn til at den reelle renheten avhenger av lagringsforholdene.
Kun for forskningsformål. Ikke ment for konsum hos mennesker. Vitenskapelig redaksjon: Dr. Sieglinde Klaus
