Oppbevaring av peptider og holdbarhet: den komplette guiden
Dr. Sieglinde Klaus
Vitenskapelig redaksjon · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Vitenskapelig redaksjon · Bergdorf Bioscience
Lyofiliserte forskningspeptider holder seg mest stabile når de oppbevares tørt, mørkt og dypfryst: ved -20 grader celsius i flere år, eventuelt -80 grader celsius for lengst mulig holdbarhet. Rekonstituerte løsninger hører hjemme i kjøleskapet ved 2 til 8 grader celsius og bør brukes opp i løpet av noen få uker. Gjentatt frysing og tining er den største fienden til molekylets integritet.
Peptider er korte aminosyrekjeder hvis funksjon er knyttet til en presis kjemisk struktur. Allerede små nedbrytningsprosesser kan senke renheten til et forskningspreparat målbart. De viktigste nedbrytningsveiene er hydrolyse av peptidbindingen, oksidasjon av følsomme rester som metionin, cystein og tryptofan, samt deamidering av asparagin og glutamin. Disse reaksjonene går desto raskere jo mer vann, varme, lys og oksygen som er til stede.
I en omfattende oversikt over stabiliteten til proteinlegemidler beskriver Manning et al., 2010 både kjemisk ustabilitet (deamidering, oksidasjon, hydrolyse, racemisering) og fysisk ustabilitet (aggregering, utfelling, denaturering, adsorpsjon til overflater) som de sentrale mekanismene. Avgjørende for praksis: disse to kategoriene er knyttet sammen, et kjemisk endret molekyl har større tendens til å aggregere.
For laboratorieoppbevaring av forskningsmateriale betyr dette et klart prinsipp: fjern vann eller frys molekylenes bevegelighet. Lyofiliserte (frysetørkede) peptider befinner seg i en tørr, glassaktig matriks der nedbrytningsreaksjoner praktisk talt stopper opp. Så snart vann tilsettes, begynner klokken å tikke. Den som vil maksimere holdbarheten, minimerer derfor fuktighet, holder temperaturen lav og reduserer kontakt med luft og lys gjennom hele oppbevaringstiden.
Den mest stabile formen av et forskningspeptid er det lyofiliserte pulveret. Ved frysetørking fjernes vann under vakuum, slik at det oppstår en amorf, glassaktig matriks som fysisk fikserer molekylene og dramatisk bremser hydrolytiske og oksidative prosesser. Wang, 200000423-3) beskriver i sin innflytelsesrike oversikt at proteiner ofte må overføres til fast form for å oppnå akseptabel holdbarhet, og at oppbevaringstemperaturen bør ligge tydelig under glassovergangstemperaturen.
For praksis i laboratoriet gjelder: lyofilisert pulver oppbevares ved -20 grader celsius, noe som gir flerårig stabilitet for de fleste sekvenser. For spesielt følsomme peptider, for eksempel slike med cystein- eller metioninrester, eller for en planlagt oppbevaring over flere år, er -80 grader celsius å foretrekke, fordi nedbrytningen her forblir nærmest neglisjerbar.
Viktig er en lufttett lukket beholder. Restfuktighet er den kritiske faktoren: allerede små mengder vann senker den kjemiske stabiliteten, og derfor bør originalhetteglasset holdes lukket og et tørkemiddel i oppbevaringsbeholderen være fornuftig. Unngå dessuten frostfrie (No-Frost) fryseapparater, fordi deres automatiske avrimingssykluser hever temperaturen periodisk og dermed skaper utilsiktede delvise tineprosesser. Merk hvert hetteglass med substans, batch og mottaksdato, slik at holdbarheten forblir sporbar. En konstant, lav temperatur uten svingninger er mer verdt enn en av og til enda lavere verdi.
Så snart et peptid er rekonstituert med bakteriostatisk vann, forlater det den beskyttende tørrformen og befinner seg igjen i et vandig miljø der hydrolyse og oksidasjon foregår aktivt. Den rekonstituerte løsningen hører derfor hjemme i kjøleskapet ved 2 til 8 grader celsius og bør ikke bli stående i romtemperatur. I dette temperaturområdet forblir mange peptider brukbare i noen uker, avhengig av sekvens og følsomhet.
Tilsetningen virker bakteriostatisk på en avgjørende måte: bakteriostatisk vann inneholder 0,9 prosent benzylalkohol, som hemmer mikrobiell vekst og dermed i det hele tatt gjør en flere uker lang kjøleskapoppbevaring av løsningen fornuftig. Rent vann uten konserveringsmiddel gir ikke denne beskyttelsen. Den nøyaktige fremgangsmåten ved oppløsning forklarer vår veiledning om å rekonstituere peptider.
Bufferkjemien påvirker stabiliteten målbart. Oksidasjon og deamidering er pH- og temperaturavhengige: Manning et al., 2010 viser at deamidering forløper basekatalysert og går spesielt raskt i sekvenser med asparagin-glysin, mens metioninoksidasjonen når sitt maksimum i det nøytrale området. For laboratoriepraksis betyr dette: hold kjølig, beskytt mot lys, tillat minst mulig luftkontakt og oppbevar løsningen ikke lenger enn nødvendig. Den som rekonstituerer større mengder, bør tenke over å dele opp i alikvoter, noe vi tar for oss i neste avsnitt.
Hver fryse-tine-syklus stresser oppløste peptider på fysisk nivå. Ved frysing dannes iskrystaller hvis vekst skaper mekaniske krefter og tvinger molekylene i tett kontakt; samtidig oppkonsentreres oppløste stoffer i de gjenværende flytende områdene, noe som skaper lokalt ekstreme forhold. Resultatet er aggregering og et snikende tap av intakt virkestoff.
Jain et al., 2021 undersøkte i Scientific Reports målrettet fryse-tine-stresset til et monoklonalt antistoff og viste at aggregeringen kan reduseres betydelig gjennom optimaliserte fryse- og tineforhold. Studien gir et rammeverk for hvordan skader kan minimeres fra laboratorieskala til produksjon. Den overførbare innsikten: det er ikke frysingen i seg selv som er problemet, men forholdene og hyppigheten av syklusene.
I praksis betyr dette en enkel regel: begrens antallet fryse-tine-sykluser. Korte, enkle peptider tåler ofte flere sykluser med lite tap, mens lengre og mer komplekst foldede sekvenser allerede etter to til tre sykluser kan ta målbar skade. Rask frysing ved -80 grader celsius og rask tining ved romtemperatur holder belastningen innenfor én syklus lav. Den som fryser og tiner den samme stamløsningen igjen og igjen, fremskynder nedbrytningen unødvendig. Løsningen er alikvotering.
Alikvotering betegner oppdelingen av en rekonstituert stamløsning i flere små porsjoner (alikvoter) som fryses hver for seg. I stedet for å tine og fryse igjen ett enkelt hetteglass ved hvert uttak, tiner man bare den alikvoten man trenger der og da. Hvert hetteglass gjennomgår dermed ideelt sett nøyaktig én fryse-tine-syklus, i stedet for mange. Dette én-tine-prinsippet regnes i laboratoriepraksis som den mest effektive beskyttelsen mot fryse-tine-betinget nedbrytning.
Grunnen ligger i ujevnheten i nedbrytningen: hver tineprosess er en anledning til delvis degradering, aggregering eller adsorpsjon til hetteglassveggen, og disse endringene fordeler seg ikke jevnt over alle molekylene. Ved å dele stamløsningen i porsjoner tidlig, fryser man størsteparten i en definert utgangstilstand. Anbefalingen fra Jain et al., 2021 om å kontrollere fryse-tine-forholdene lar seg slik direkte oversette til en enkel arbeidsprotokoll.
Praktisk deler man løsningen i sterile, merkede mikrorør hvis størrelse er tilpasset det vanlige forbruket per eksperiment. Bruk proteinfattige beholdere for å redusere adsorpsjonstap, og fyll ikke helt fullt, fordi frysende væske utvider seg. Merk hver alikvot med substans, konsentrasjon og dato. Ubrukte rester av en opptint alikvot kastes i stedet for å fryses på nytt. Slik holder hovedbeholdningen seg i konstant kvalitet over måneder, mens bare små mengder utsettes for tinestress.
Ved siden av vann og varme er lys og oksygen to ofte undervurderte drivere av nedbrytning. Oksidasjon rammer fremfor alt de svovelholdige restene metionin og cystein samt det aromatiske tryptofanet. Metionin oksideres til metioninsulfoksid og videre til sulfonet, og denne omdanningen er praktisk talt irreversibel. Oksygen fra luften og lys fremskynder denne prosessen, og derfor bør kontakten med begge minimeres.
Badgett et al., 2017 viste ved hjelp av HILIC-massespektrometri at peptider med oksidert metionin og deamidert asparagin lar seg skille rent fra sine uendrede motstykker og kvantifisere. Det dokumenterer at disse modifikasjonene er reelt forekommende, målbare endringer, ikke teoretiske risikoer. For oppbevaringen følger det av dette at ethvert tiltak for å redusere lys- og lufteksponering bevarer den intakte andelen.
Konkret betyr det: oppbevar peptider i lystette eller ravfargede beholdere, eventuelt i originalkartongen, langt fra vinduslys og UV-kilder. Hold hetteglasset lukket mellom uttakene for å begrense luftkontakten. For sekvenser som er spesielt utsatt for oksidasjon, kan overlagring med en inert gass som nitrogen eller argon fortrenge restoksygenet i hetteglassets topprom. I kombinasjon med lav temperatur og tørrhet gir beskyttelsen mot lys og oksygen et helhetlig vernekonsept som forlenger den brukbare holdbarheten til forskningsmateriale betydelig.
Hjelpestoffer (eksipienser) i det lyofiliserte produktet bidrar vesentlig til oppbevaringsstabiliteten. Disakkarider som trehalose og sukrose regnes som de mest effektive lyoprotektorene: de danner hydrogenbroer til peptidets polare grupper og erstatter dermed den stabiliserende rollen til det fjernede vannet i den glassaktige matriksen. Karunnanithy et al., 2024 rapporterer at trehalose ofte gjør det bedre enn sukrose, fordi dens langsommere molekylære rotasjon forstyrrer proteinstrukturen mindre.
Like avgjørende er restfuktigheten til det ferdige lyofilisatet. En lav restfuktighet holder produktet under glassovergangstemperaturen og dermed i den stabile glassaktige tilstanden; stiger fuktigheten, synker den kjemiske stabiliteten uavhengig av om materialet foreligger glassaktig eller allerede gummiaktig. Disse sammenhengene går tilbake til det grunnleggende arbeidet til Wang, 200000423-3), som behandler kryo- og lyoproteksjon utførlig.
For oppbevaringspraksisen gir dette flere håndtak. Oppbevar peptidet i originalhetteglasset med intakt septum for å forhindre fuktighetsopptak. Legg et tørkemiddel (silikagel) i den omkringliggende oppbevaringsbeholderen, særlig når hetteglass tas ut av fryseren, fordi det dannes kondensvann ved oppvarming. La derfor lukkede hetteglass komme til romtemperatur før de åpnes, slik at ingen fuktighet kondenserer inne i glasset. Disse små forholdsreglene beskytter den møysommelig oppbygde tørrstabiliteten og forhindrer at inntrengt fuktighet forkorter holdbarheten.
Et nedbrutt eller forurenset peptid lar seg delvis kjenne igjen med det blotte øye, delvis bare analytisk. For det lyofiliserte pulveret gjelder: et intakt preparat fremstår som en jevn, hvit til kremfarget kake eller et fint pulver. Påfallende misfarginger, en sammenfalt eller flytende kake eller synlig fuktighet i hetteglasset er varselstegn på fuktighetsinntrengning eller feilaktig oppbevaring.
Etter rekonstitusjonen bør en korrekt oppløst prøve være klar og partikkelfri. Uklarhet, slør, fnugg eller et synlig bunnfall tyder på aggregering eller mikrobiell forurensning, begge tegn på at materialet er uegnet for pålitelige forskningsresultater. Som beskrevet ovenfor er aggregering en direkte følge av fryse-tine-stress og fysisk ustabilitet, som Manning et al., 2010 benevner som en kjernemekanisme.
Den pålitelige vurderingen av renheten skjer imidlertid instrumentelt. Metoden til Badgett et al., 2017 demonstrerer at oksiderte og deamiderte varianter lar seg skille kromatografisk fra den intakte arten og kvantifisere; i praksis brukes HPLC og massespektrometri til dette. Synlige endringer er altså bare det grove første trinnet. For kvantitativ forskning anbefales det å dokumentere mottaksdatoen, protokollføre synlige avvik og i tvilstilfeller ty til en analytisk karakterisering før tvilsomt materiale inngår i et eksperiment.
Den realistiske holdbarheten avhenger sterkt av peptidets tilstand. Som lyofilisert pulver ved -20 grader celsius forblir mange sekvenser stabile i flere år; ved -80 grader celsius er nedbrytningen så liten at en svært lang oppbevaring er mulig. Ved romtemperatur derimot forkortes den brukbare holdbarheten drastisk, fordi hydrolyse og oksidasjon går tydelig raskere.
Rekonstituerte løsninger er betydelig mer kortlivede. I kjøleskapet ved 2 til 8 grader celsius regnes noen uker som en vanlig ramme, avhengig av sekvens og følsomhet; peptider som er utsatt for oksidasjon eller deamidering ligger i nedre ende av dette spennet. Nettopp derfor er tidlig alikvotering og frysing ved -20 eller -80 grader celsius så verdifullt: det overfører den kortlivede løsningen tilbake til en mer langlivet tilstand uten å utsette den for gjentatt tinestress.
De nøyaktige tallene varierer etter sekvens, formulering og tilstedeværende hjelpestoffer, og derfor understreker Manning et al., 2010 at sekvens, sensitive rester og formulering sammen bestemmer stabiliteten. Behandle derfor holdbarhetsangivelser som sekvensavhengige veiledende verdier, ikke som faste garantier. En god tommelfingerregel for laboratoriet: tørr og dypfryst, tenk i år; oppløst og kjølt, tenk i uker. Den som er usikker ved oppløsning, finner grunnlaget i vår veiledning Hva er peptider? samt i den detaljerte anvisningen om rekonstituering.
I prinsippet ja, men hver ekstra fryse-tine-syklus øker risikoen for aggregering og tap av virkestoff. Jain et al., 2021 viser at fryse-tine-skader kan reduseres gjennom kontrollerte forhold. Tydelig bedre er det imidlertid å alikvotere løsningen helt fra starten og tillate bare én eneste tineprosess per alikvot.
For mange lyofiliserte peptider er -20 grader celsius tilstrekkelig, så lenge apparatet ikke har et No-Frost-system med automatiske avrimingssykluser, fordi disse hever temperaturen periodisk. For flerårig oppbevaring eller spesielt følsomme sekvenser er en -80-graders celsius-fryser å foretrekke, fordi nedbrytningen der nesten stopper helt opp.
Kaldt glass trekker til seg kondensvann ved kontakt med romluft. Åpner man et iskaldt hetteglass med en gang, kommer fuktighet på pulveret og fremskynder hydrolyse og nedbrytning. Lar man derimot den lukkede beholderen temperere først, forblir innholdet tørt og den møysommelig oppnådde tørrstabiliteten bevares.
Nei, benzylalkoholen som er tilsatt virker antimikrobielt, ikke kjemisk stabiliserende. Den forhindrer mikrobiell vekst og gjør slik en flere uker lang kjøleskapoppbevaring av en løsning fornuftig, men beskytter ikke mot hydrolyse eller oksidasjon. Disse kontrolleres fortsatt gjennom kjøling, lysbeskyttelse og begrenset luftkontakt.
Avhengig av sekvens og følsomhet regnes noen uker ved 2 til 8 grader celsius som en vanlig ramme. Peptider som er utsatt for oksidasjon eller deamidering ligger i nedre ende. Siden den nøyaktige holdbarheten er sekvensavhengig, dokumenterer man rekonstitusjonsdatoen og kaster løsninger med synlig uklarhet eller bunnfall.
Kun for forskningsformål. For research purposes only. Not for human consumption.
Vitenskapelig redaksjon: Dr. Sieglinde Klaus
Slik rekonstituerer du lyofiliserte forskningspeptider med bakteriostatisk vann: trinn, mengdeberegning og oppbevaring for rent laboratoriearbeid.
Was sind Peptide? Herstellung (SPPS), Reinheit (HPLC), Lyophilisierung. Mit 7 PubMed-Referenzen. Wissenschaftlich fundierter Leitfaden.