Ako správne čítať čistotu HPLC a CoA pri peptidoch
Dr. Sieglinde Klaus
Vedecká redakcia · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Vedecká redakcia · Bergdorf Bioscience
Čistota HPLC udáva, aký percentuálny podiel plochy chromatogramu pripadá na cieľový peptid, zatiaľ čo Certificate of Analysis (CoA) dokumentuje túto hodnotu spolu s identitou potvrdenou hmotnostnou spektrometriou, šaržou a použitými skúšobnými metódami. Hodnota >=99 % znamená, že v signáli UV detektora pripadá na vedľajšie zložky len veľmi malá plocha. Tento sprievodca vysvetľuje, ako oba tieto údaje vznikajú a ako si ich overiť.
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) rozdeľuje rozpustenú peptidovú zmes podľa fyzikálno-chemických vlastností a tak zviditeľňuje, z koľkých zložiek sa vzorka skladá. V analytike peptidov dominuje reverzno-fázová HPLC (RP-HPLC) na kolónach C18, C8 alebo C4, pretože rozdeľuje molekuly podľa ich hydrofóbnosti a pritom poskytuje vysokú rozlišovaciu schopnosť. Podľa metodického prehľadu Mant et al., 2007 sa HPLC už viac ako 25 rokov považuje za najuniverzálnejší postup na izoláciu a stanovenie čistoty syntetických peptidov.
Konkrétne preteká kolónou mobilná fáza, väčšinou gradient vody a acetonitrilu s 0,05 až 0,1 % kyseliny trifluóroctovej (TFA). Každá zložka opúšťa kolónu v charakteristickom čase, retenčnom čase, a na UV detektore (zvyčajne 214 alebo 220 nm, kde absorbuje peptidová väzba) vytvára pík. HPLC teda nemeria identitu látky, ale jej separačné správanie a relatívny podiel množstva. Na vyjadrenie identity je potrebná druhá metóda, hmotnostná spektrometria.
Percentuálny údaj čistoty HPLC opisuje podiel plochy hlavného píku na celkovej ploche všetkých detegovaných píkov. Pri 99 % teda pripadá 99 % integrovanej plochy UV signálu na cieľový peptid a iba 1 % na všetky vedľajšie zložky spolu. Dôležité je, že ide o relatívny údaj plochy, nie o údaj hmotnosti: zvyškové rozpúšťadlá, soli alebo voda, ktoré pri 214 nm takmer neabsorbujú, sa do tejto hodnoty nezapočítavajú. Preto seriózni výrobcovia dopĺňajú čistotu HPLC o ďalšie ukazovatele, ako je čistý obsah peptidu.
Vedľajšie zložky pochádzajú väčšinou zo syntézy na pevnej fáze. Podľa Boysen & Hearn, 2006 vznikajú pri postupnej syntéze predovšetkým delečné sekvencie (chýbajúca aminokyselina), skrátené sekvencie, ako aj produkty neúplného odštiepenia ochranných skupín alebo racemizácie. Práve tieto chemicky veľmi podobné nečistoty sa ťažko oddeľujú a určujú, aká vysoká čistota je dosiahnuteľná. Skok z 95 % na 99 % teda znamená, že tieto príbuzné látky boli z veľkej časti odstránené. Viac informácií o samotnej triede látok nájdete v sprievodcovi Čo sú peptidy?.
CoA je skúšobný protokol konkrétnej šarže a združuje výsledky všetkých vykonaných analýz do jedného dokumentu. Zvyčajne uvádza názov produktu, sumárny vzorec a teoretickú molekulovú hmotnosť, číslo šarže, dátum výroby alebo skúšky, ako aj použité metódy. Jadro tvoria dva bloky: potvrdenie identity hmotnostnou spektrometriou a stanovenie čistoty pomocou HPLC. Často sa navyše uvádza aj výsledok posúdenia vzhľadu (biely lyofilizát) a obsah vody.
Rozhodujúce je, že spoľahlivé CoA zobrazuje pôvodné dáta a nie len tvrdí nejaké číslo. K tomu patrí zobrazený HPLC chromatogram s retenčným časom a integračnými plochami, ako aj hmotnostné spektrum s nameranou hodnotou m/z. Odborne zdatná osoba si tak môže tvrdenia overiť, namiesto toho, aby im len verila. Údaje o metóde by mali byť presné, napríklad typ kolóny, gradient, detekčná vlnová dĺžka a použitý ionizačný postup. V BergdorfBio slúži CoA viazané na šaržu ako doklad pre prísľub >=99 % HPLC a CoA uvedený na úvodnej stránke. Produkty ako BPC-157 alebo Retatrutid sa vždy dodávajú s takýmto dokumentom k šarži.
Zatiaľ čo HPLC ukazuje len separačné správanie, hmotnostná spektrometria odpovedá na otázku, či ide o správnu molekulu. V analytike peptidov dominuje ionizácia elektrosprejom (ESI), šetrný ionizačný postup, ktorý prevádza molekuly do plynnej fázy bez fragmentácie. Podľa Banerjee & Mazumdar, 2012 vytvára ESI viacnásobne nabité ióny, čím sa merateľný rozsah m/z výrazne rozširuje a presne určiť možno aj veľké peptidy.
Na CoA sa nameraná molekulová hmotnosť porovnáva s teoretickou hodnotou vypočítanou zo sumárneho vzorca. Ak sa obe zhodujú na niekoľko hmotnostných jednotiek, identita peptidu je potvrdená. Odchýlka napríklad o 18 hmotnostných jednotiek by mohla poukazovať na stratu vody, väčší rozdiel na nesprávnu alebo znečistenú sekvenciu. Spojenie oboch metód, teda LC-MS, je obzvlášť výpovedné: Toll et al., 2005 ukázali, že vyše 50 peptidov tryptického štiepenia sa dá za 15 až 20 minút rozdeliť a súčasne identifikovať pomocou ESI-MS. Identita a čistota sa tak zachytia v jednom behu.
Chromatogram je grafickým jadrom každého CoA: na osi x je čas v minútach, na osi y odozva detektora, väčšinou v miliabsorpčných jednotkách (mAU). Cieľový peptid sa objavuje ako vysoký, úzky hlavný pík vo svojom charakteristickom retenčnom čase, napríklad pri 8 až 12 minútach podľa metódy. Čisto spracovaná vzorka vykazuje jediný, ostrý a symetrický pík s jasným oddelením od základnej línie voči prípadným vedľajším píkom.
Pri čítaní sledujte tri veci. Po prvé tvar píku: silne skosený pík (chvostovanie) alebo rozšírená báza môžu poukazovať na koeluujúce nečistoty alebo problémy s kolónou. Po druhé malé vedľajšie píky: tie predstavujú vedľajšie produkty syntézy; súčet ich plôch dáva chýbajúci percentuálny podiel do hranice 100 %. Po tretie základnú líniu: mala by prebiehať plocho a pokojne, bez driftu. Integrácia, teda matematické stanovenie plochy pod každým píkom, napokon poskytne percentuálne hodnoty. Mobilná fáza s obsahom TFA pritom zlepšuje ostrosť píku, pretože TFA ako iónovo-párové činidlo maskuje zásadité bočné reťazce peptidu a tak vytvára homogénnejšie eluačné správanie (Mant et al., 2007).
Samostatný percentuálny údaj bez kontextu má malú hodnotu, pretože závisí od metódy. Tá istá vzorka môže na dvoch rôznych kolónach alebo pri dvoch detekčných vlnových dĺžkach poskytnúť mierne odlišné hodnoty, keďže separácia a UV absorpcia vedľajších zložiek sa líšia. Čistota 99 %, nameraná len pri jednej vlnovej dĺžke, presvedčí až vtedy, keď je metóda úplne zdokumentovaná a priložený je príslušný chromatogram. Holé číslo bez spektra sa nedá overiť.
K tomu sa pridáva, že čistota HPLC nezachytáva UV-neaktívne zložky. Soli zo syntézneho a čistiaceho procesu, napríklad acetátové alebo trifluóracetátové protióny, ako aj zvyšková voda prispievajú hmotnosťou, bez toho aby sa objavili v chromatograme. Preto je čistý obsah peptidu, často stanovený analýzou aminokyselín alebo stanovením dusíka, zmysluplným doplnkom: udáva, koľko čistého peptidu je skutočne obsiahnutého v jednom miligrame prášku. Identita (MS), relatívna čistota (HPLC) a absolútny obsah sú tri rozdielne otázky, ktoré dobré CoA zodpovedá oddelene.
Každá výrobná séria je samostatný chemický proces s vlastnými výkyvmi, a preto musí byť CoA vždy priradené ku konkrétnej šarži. Všeobecný technický list, ktorý by mal platiť pre všetky kedy vyrobené jednotky produktu, nie je dokladom o skúške, ale reklamným tvrdením. Až číslo šarže na dokumente prepája namerané hodnoty s fyzickým materiálom v liekovke pred vami. Retenčný čas, hmotnostné spektrum a čistota platia presne pre túto výrobnú jednotku.
Je to relevantné aj preto, že profil nečistôt sa môže medzi šaržami líšiť. Jedna šarža dosiahne možno 99,2 %, iná 98,6 % s mierne odlišným vzorom vedľajších píkov. Túto realitu zobrazuje len CoA viazané na šaržu. Prakticky by ste mali porovnať číslo šarže na štítku s číslom na CoA, skontrolovať dátum skúšky a uistiť sa, že chromatogram je skutočne priložený. Ak chýba väzba na šaržu alebo pôvodný technický list, údaj o čistote nie je overiteľný, bez ohľadu na to, aké vysoké je dané číslo.
Malé píky vedľa hlavného píku nie sú náhoda, ale majú definované chemické príčiny. Zo syntézy na pevnej fáze pochádzajú predovšetkým delečné peptidy, pri ktorých sa počas budovania reťazca vynechala aminokyselina, ako aj skrátené sekvencie v dôsledku predčasného prerušenia reťazca. Okrem toho sa vyskytujú produkty neúplného odštiepenia ochranných skupín, pri ktorých na molekule zostávajú ochranné skupiny, a tiež racemizačné produkty so zmenenou stereochémiou. Tieto príbuzné látky sa od cieľového peptidu často líšia len minimálne a podľa toho eluujú blízko hlavného píku.
Po skladovaní môžu pribudnúť ďalšie produkty rozkladu. Podľa prehľadu Lai & Topp, 1999 patria k najdôležitejším chemickým reakciám v pevnom stave deamidácia, štiepenie peptidovej väzby, oxidácia, Maillardova reakcia, beta-eliminácia a agregácia. V chromatograme sa takéto procesy prejavujú ako nové alebo rastúce vedľajšie píky. CoA vytvorené priamo po syntéze teda dokumentuje východiskový stav; skutočný profil vo výskumnom laboratóriu navyše závisí od manipulácie a skladovania.
Čistota zdokumentovaná na CoA platí pre okamih merania, väčšinou priamo po syntéze a prečistení. Výskumné peptidy sa preto takmer vždy dodávajú ako lyofilizát, teda ako lyofilizovaný prášok, pretože odňatie vody výrazne spomaľuje hydrolytické a oxidatívne cesty rozkladu. Podľa Lai & Topp, 1999 je chemická stabilita v pevnom stave určená rozhodujúcou mierou teplotou, zvyškovou vlhkosťou a skupenstvom; už malá zvyšková vlhkosť môže urýchliť agregáciu.
V praxi to znamená: aj ten najkrajší údaj 99 % je málo platný, ak sa materiál následne nesprávne skladuje. Chladné, suché a pred svetlom chránené uchovávanie uzavretého lyofilizátu zachováva profil zdokumentovaný na CoA najdlhšie. Keď sa peptid rekonštituuje, teda prevedie do roztoku, začínajú reakcie rozkladu závislé od vody prebiehať rýchlejšie a pôvodný chromatogram stráca svoju platnosť. Kto chce správne interpretovať údaje o čistote, musí preto rozlišovať medzi okamihom merania a okamihom použitia: CoA opisuje stav pri dodaní, nie trvalý stav počas celej doby používania.
Systematická kontrola trvá len niekoľko minút a robí abstraktné hodnoty uchopiteľnými. Prejdite dokument v tomto poradí:
Ak niektorý z týchto bodov chýba, CoA je neúplné. Obzvlášť kritické je chýbanie pôvodných grafov: bez chromatogramu a spektra ostáva číslo čistoty len číre tvrdenie. Naopak, úplný dokument viazaný na šaržu so všetkými surovými dátami je najsilnejším signálom kvality, ktorý môže výskumný peptid mať. Umožňuje vám overiť si tvrdenia samostatne, namiesto toho, aby ste sa spoliehali na izolované číslo.
Čistota HPLC je relatívny údaj plochy a hovorí, aký podiel UV-aktívnych zložiek pripadá na cieľový peptid. Obsah peptidu naproti tomu udáva, koľko čistého peptidu je obsiahnutého v jednom miligrame celkového prášku, a zohľadňuje aj UV-neaktívne zložky ako soli a zvyškovú vodu. Obe hodnoty sa dopĺňajú a mali by sa posudzovať oddelene.
Nie automaticky, pretože číslo závisí od metódy. Zdokumentovaný chromatogram pri 98 % môže byť výpovednejší ako holý údaj 99 % bez pôvodných dát. Rozhodujúce je, aby bola čistota doložená overiteľným chromatogramom viazaným na šaržu a aby bola jasne uvedená metóda merania.
HPLC rozdeľuje len podľa fyzikálno-chemických vlastností a ukazuje separačné správanie, nie molekulové zloženie. Dve rôzne molekuly by teoreticky mohli eluovať podobne. Až hmotnostná spektrometria meria molekulovú hmotnosť a porovnaním s teoretickou hodnotou potvrdzuje, že skutočne ide o cieľový peptid.
CoA dokumentuje stav v okamihu skúšky, väčšinou priamo po syntéze. Ostáva platným dokladom o pôvode, ale neopisuje stav po dlhom alebo nesprávnom skladovaní. Sledujte uvedený dátum skúšky a zohľadnite, že skutočná čistota závisí od podmienok skladovania.
Len na výskumné účely. Nie je určené na ľudskú spotrebu. Vedecká redakcia: Dr. Sieglinde Klaus
