Peptitlerde HPLC saflığı ve CoA nasıl doğru okunur
Dr. Sieglinde Klaus
Bilimsel Redaksiyon · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Bilimsel Redaksiyon · Bergdorf Bioscience
HPLC saflığı, bir kromatogramın yüzde olarak hangi alan payının hedef peptide ait olduğunu gösterir; Certificate of Analysis (CoA, Analiz Sertifikası) ise bu değeri kütle spektrometrisiyle doğrulanmış kimlik, parti (lot) bilgisi ve test yöntemleriyle birlikte belgeler. >=99% değeri, UV dedektör sinyalinde yan bileşenlere yalnızca çok küçük bir alanın düştüğü anlamına gelir. Bu rehber, her iki bilginin nasıl ortaya çıktığını ve bunları nasıl kontrol edeceğinizi açıklar.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), çözünmüş bir peptit karışımını fizikokimyasal özelliklerine göre ayırır ve böylece bir numunenin kaç bileşenden oluştuğunu görünür kılar. Peptit analizinde ters faz HPLC (RP-HPLC) baskındır; C18, C8 veya C4 kolonlarında çalışır, çünkü molekülleri hidrofobikliklerine göre ayırır ve bunu yaparken yüksek bir ayırma keskinliği sağlar. Mant ve ark., 2007 tarafından yapılan yöntem derlemesine göre HPLC, 25 yılı aşkın süredir sentetik peptitlerin izolasyonu ve saflık tayini için en çok yönlü yöntem olarak kabul edilmektedir.
Somut olarak, çoğunlukla su ve asetonitrilden oluşan, yüzde 0,05 ile 0,1 arası trifloroasetik asit (TFA) içeren bir gradyan olan mobil faz kolonun içinden geçer. Her bileşen kolonu kendine özgü bir zamanda, yani alıkonma süresinde terk eder ve UV dedektöründe (peptit bağının absorpsiyon yaptığı, tipik olarak 214 veya 220 nm dalga boyunda) bir pik oluşturur. Yani HPLC bir maddenin kimliğini değil, ayrılma davranışını ve göreceli miktar payını ölçer. Bir kimlik beyanı için ikinci bir yönteme, yani kütle spektrometrisine ihtiyaç vardır.
HPLC saflığının yüzde değeri, ana pikin tespit edilen tüm piklerin toplam alanı içindeki alan payını ifade eder. 99% durumunda, entegre edilen UV sinyal alanının 99%'u hedef peptide, yalnızca 1%'i ise tüm yan bileşenlerin tamamına düşer. Önemli olan, bunun bir ağırlık beyanı değil göreceli bir alan beyanı olmasıdır: 214 nm'de neredeyse hiç absorpsiyon yapmayan kalıntı çözücüler, tuzlar veya su bu değere dahil olmaz. Bu nedenle ciddi üreticiler HPLC saflığını net peptit içeriği gibi başka karakteristik değerlerle tamamlar.
Yan bileşenler çoğunlukla katı faz sentezinden kaynaklanır. Boysen ve Hearn, 2006 verilerine göre, adım adım sentez sırasında özellikle delesyon dizileri (eksik bir aminoasit), kısalmış diziler ve eksik koruma grubu giderme ya da rasemizasyondan kaynaklanan ürünler oluşur. Tam da kimyasal olarak birbirine çok benzeyen bu safsızlıkları ayırmak zordur ve ulaşılabilir saflığın ne kadar yüksek olacağını belirler. Dolayısıyla 95%'ten 99%'a bir sıçrama, bu akraba bileşenlerin büyük ölçüde uzaklaştırıldığı anlamına gelir. Madde sınıfının kendisi hakkında daha fazla arka plan bilgisini Peptit nedir? rehberinde bulabilirsiniz.
Bir CoA, belirli bir partinin test protokolüdür ve yapılan tüm analizlerin sonuçlarını tek bir belgede toplar. Tipik olarak ürün adını, molekül formülünü ve teorik molekül ağırlığını, parti numarasını, üretim veya test tarihini ve uygulanan yöntemleri belirtir. Çekirdeğini iki blok oluşturur: kütle spektrometrisiyle kimlik doğrulaması ve HPLC ile saflık tayini. Sıklıkla ek olarak görünüm bulgusu (beyaz liyofilizat) ve su içeriği de belirtilir.
Belirleyici olan, güvenilir bir CoA'nın yalnızca bir sayı iddia etmek yerine orijinal verileri göstermesidir. Buna alıkonma süresi ve entegrasyon alanlarıyla birlikte gösterilen HPLC kromatogramı ile ölçülen m/z değerini içeren kütle spektrumu dahildir. Böylece uzman bir kişi beyanları sadece kabul etmek yerine doğrulayabilir. Yöntem bilgileri kesin olmalıdır; örneğin kolon tipi, gradyan, deteksiyon dalga boyu ve kullanılan iyonizasyon yöntemi. BergdorfBio'da partiye özel CoA, ana sayfada belirtilen >=99% HPLC ve CoA taahhüdünün kanıtı olarak hizmet eder. BPC-157 veya Retatrutid gibi ürünler, ilgili partiye ait böyle bir belgeyle birlikte teslim edilir.
HPLC yalnızca ayrılma davranışını gösterirken, kütle spektrometrisi doğru molekülün mevcut olup olmadığı sorusunu yanıtlar. Peptit analizinde, molekülleri parçalanma olmadan gaz fazına aktaran yumuşak bir iyonizasyon yöntemi olan elektrosprey iyonizasyonu (ESI) baskındır. Banerjee ve Mazumdar, 2012 verilerine göre ESI, çok yüklü iyonlar üretir; böylece ölçülebilir m/z aralığı belirgin şekilde genişler ve büyük peptitler bile hassas bir şekilde belirlenebilir.
CoA üzerinde, ölçülen molekül ağırlığı, molekül formülünden hesaplanan teorik değerle karşılaştırılır. Her ikisi birkaç kütle birimi farkla uyuşuyorsa, peptidin kimliği doğrulanmış demektir. Örneğin 18 kütle biriminlik bir sapma bir su kaybına, daha büyük bir fark ise yanlış ya da kirlenmiş bir diziye işaret edebilir. Her iki yöntemin birleştirilmesi, yani LC-MS, özellikle açıklayıcıdır: Toll ve ark., 2005 triptik bir sindirimin 50'den fazla peptidinin 15 ila 20 dakikada ayrılabildiğini ve aynı anda ESI-MS ile tanımlanabildiğini gösterdiler. Kimlik ve saflık böylece tek bir çalışmada elde edilir.
Kromatogram, her CoA'nın grafiksel çekirdek beyanıdır: x ekseninde dakika cinsinden zaman, y ekseninde ise çoğunlukla miliabsorpsiyon birimi (mAU) cinsinden dedektör yanıtı yer alır. Hedef peptit, yönteme bağlı olarak yaklaşık 8 ila 12 dakika gibi kendine özgü alıkonma süresinde yüksek, dar bir ana pik olarak görünür. Temiz bir şekilde çalışılmış bir numune, olası yan piklere göre net bir taban çizgisi ayrımına sahip, tek, keskin ve simetrik bir pik gösterir.
Okurken üç şeye dikkat edin. Birincisi pik şekli: Belirgin şekilde çarpık bir pik (kuyruklanma) veya genişlemiş bir taban, koelüsyona uğrayan safsızlıklara ya da kolon sorunlarına işaret edebilir. İkincisi küçük yan pikler: Bunlar sentez yan ürünlerini temsil eder; alan toplamları, 100% çizgisine kadar eksik kalan yüzde payını verir. Üçüncüsü taban çizgisi: Kayma olmadan düz ve sakin bir seyir izlemelidir. Her pikin altındaki alanın hesaplamayla belirlenmesi olan entegrasyon ise sonunda yüzde değerlerini verir. TFA içeren bir mobil faz, pik keskinliğini iyileştirir; çünkü TFA, bir iyon çifti reaktifi olarak peptidin bazik yan zincirlerini maskeler ve böylece daha homojen bir elüsyon davranışı oluşturur (Mant ve ark., 2007).
Bağlamı olmayan tek bir yüzde beyanı pek değerli değildir, çünkü yönteme bağlıdır. Aynı numune iki farklı kolonda ya da iki farklı deteksiyon dalga boyunda biraz farklı değerler verebilir; çünkü ayrılma ve yan bileşenlerin UV absorpsiyonu değişkenlik gösterir. Yalnızca tek bir dalga boyunda ölçülen 99% saflık, ancak yöntem eksiksiz belgelendiğinde ve ilgili kromatogram eklendiğinde inandırıcı olur. Spektrumu olmayan çıplak bir sayı doğrulanamaz.
Buna ek olarak, HPLC saflığı UV aktif olmayan bileşenleri kapsamaz. Sentez ve saflaştırma sürecinden kaynaklanan tuzlar, örneğin asetat veya trifloroasetat karşı iyonları ve kalıntı su, kromatogramda görünmeden kütleye katkıda bulunur. Bu nedenle, genellikle aminoasit analizi ya da azot tayini ile belirlenen net peptit içeriği anlamlı bir tamamlayıcıdır: Milligram toz başına gerçekte ne kadar saf peptit bulunduğunu söyler. Kimlik (MS), göreceli saflık (HPLC) ve mutlak içerik, iyi bir CoA'nın ayrı ayrı yanıtladığı üç farklı sorudur.
Her sentez serisi, kendine özgü dalgalanmaları olan ayrı bir kimyasal süreçtir; bu nedenle bir CoA her zaman belirli bir partiyle ilişkilendirilmiş olmalıdır. Bir ürünün üretilmiş tüm birimleri için geçerli olması gereken genel bir veri sayfası, bir test kanıtı değil, bir reklam beyanıdır. Belge üzerindeki parti numarası, ölçülen değerleri ancak önünüzdeki şişedeki fiziksel materyalle ilişkilendirir. Alıkonma süresi, kütle spektrumu ve saflık tam olarak bu üretim birimi için geçerlidir.
Bu, parti numarası bilgisinin partiler arasında farklılık gösterebilmesi nedeniyle de önemlidir. Bir parti belki 99,2%'ye ulaşır, bir diğeri ise biraz farklı bir yan pik deseniyle 98,6%'ya. Bu gerçekliği yalnızca partiye bağlı bir CoA yansıtır. Pratikte etiket üzerindeki parti numarasını CoA üzerindekiyle karşılaştırmalı, test tarihini kontrol etmeli ve kromatogramın gerçekten ekli olduğundan emin olmalısınız. Parti ilişkisi ya da orijinal veri sayfası eksikse, sayı ne kadar yüksek olursa olsun, saflık beyanı doğrulanabilir değildir.
Ana pikin yanındaki küçük pikler tesadüf değil, tanımlı kimyasal nedenleri olan piklerdir. Katı faz sentezinden özellikle, dizilim sırasında bir aminoasidin atlandığı delesyon peptitleri ve zincirin erken kopması nedeniyle kısalmış diziler kaynaklanır. Bunun yanında, koruma gruplarının molekülde kaldığı eksik koruma grubu giderme ürünleri ile değişmiş stereokimyaya sahip rasemizasyon ürünleri ortaya çıkar. Bu akraba bileşenler çoğunlukla hedef peptitten yalnızca minimal düzeyde farklıdır ve buna bağlı olarak ana pikin yakınında elüsyona uğrar.
Depolamadan sonra başka bozunma ürünleri de eklenebilir. Lai ve Topp, 1999 derlemesine göre, deamidasyon, peptit bağının yarılması, oksidasyon, Maillard reaksiyonu, beta eliminasyonu ve agregasyon, katı haldeki en önemli kimyasal reaksiyonlar arasındadır. Kromatogramda bu tür süreçler yeni ya da büyüyen yan pikler olarak kendini gösterir. Bu nedenle sentezden hemen sonra oluşturulan bir CoA başlangıç durumunu belgeler; araştırma laboratuvarındaki gerçek profil ayrıca işleme ve depolamaya da bağlıdır.
CoA üzerinde belgelenen saflık, ölçüm anı için, yani çoğunlukla doğrudan sentez ve saflaştırmadan sonrası için geçerlidir. Bu nedenle araştırma peptitleri neredeyse her zaman liyofilizat, yani dondurularak kurutulmuş toz olarak teslim edilir; çünkü suyun uzaklaştırılması hidrolitik ve oksidatif bozunma yollarını büyük ölçüde yavaşlatır. Lai ve Topp, 1999 verilerine göre katı haldeki kimyasal kararlılık esas olarak sıcaklık, kalıntı nem ve agregasyon durumu tarafından belirlenir; az miktarda kalıntı nem bile agregasyonu hızlandırabilir.
Bu pratikte şu anlama gelir: En güzel 99% beyanı, materyal daha sonra uygunsuz şekilde depolanırsa pek bir işe yaramaz. Kapalı liyofilizatın serin, kuru ve ışıktan korunarak saklanması, CoA üzerinde belgelenen profili en uzun süre korur. Bir peptit rekonstitüe edildiğinde, yani çözeltiye getirildiğinde, suya bağlı bozunma reaksiyonları daha hızlı işlemeye başlar ve orijinal kromatogram geçerliliğini yitirir. Saflık verilerini doğru yorumlamak isteyen kişi bu nedenle ölçüm ve kullanım anını birbirinden ayırmalıdır: CoA teslimat durumunu tanımlar, kullanım süresinin tamamı boyunca süregelen kalıcı durumu değil.
Sistematik bir kontrol yalnızca birkaç dakika sürer ve soyut değerleri elle tutulur hale getirir. Belgeyi şu sırayla gözden geçirin:
Bu noktalardan biri eksikse, CoA eksiktir. Özellikle kritik olan orijinal grafiklerin eksikliğidir: Kromatogram ve spektrum olmadan saflık sayısı salt bir iddia olarak kalır. Buna karşılık, tüm ham verileri içeren eksiksiz, partiye bağlı bir belge, bir araştırma peptidinin sunabileceği en güçlü kalite sinyalidir. Bu, sizi izole bir sayıya güvenmek yerine beyanları kendiniz doğrulamaya olanak tanır.
HPLC saflığı göreceli bir alan beyanıdır ve UV aktif bileşenlerin hangi payının hedef peptide düştüğünü söyler. Peptit içeriği ise milligram toplam toz başına ne kadar saf peptit bulunduğunu belirtir ve tuzlar ile kalıntı su gibi UV aktif olmayan bileşenleri de hesaba katar. Her iki değer birbirini tamamlar ve ayrı ayrı değerlendirilmelidir.
Otomatik olarak değil, çünkü bu sayı yönteme bağlıdır. 98%'de belgelenmiş bir kromatogram, orijinal verileri olmayan çıplak bir 99% beyanından daha açıklayıcı olabilir. Belirleyici olan, saflığın doğrulanabilir, partiye özel bir kromatogramla kanıtlanmış ve ölçüm yönteminin açıkça belirtilmiş olmasıdır.
HPLC yalnızca fizikokimyasal özelliklere göre ayırır ve moleküler bileşimi değil, ayrılma davranışını gösterir. İki farklı molekül teorik olarak benzer şekilde elüsyona uğrayabilir. Molekül ağırlığını ölçen ve teorik değerle karşılaştırarak gerçekten hedef peptidin mevcut olduğunu doğrulayan ancak kütle spektrometrisidir.
Bir CoA, test anındaki, yani çoğunlukla sentezden hemen sonraki durumu belgeler. Bir köken kanıtı olarak geçerli kalır, ancak uzun ya da uygunsuz depolama sonrası durumu tanımlamaz. Belirtilmiş bir test tarihine dikkat edin ve gerçek saflığın depolama koşullarına bağlı olduğunu göz önünde bulundurun.
Yalnızca araştırma amaçlıdır. İnsan tüketimi için değildir. Bilimsel redaksiyon: Dr. Sieglinde Klaus
