Ανασύσταση πεπτιδίων: Οδηγός βήμα προς βήμα
Dr. Sieglinde Klaus
Επιστημονική επιμέλεια · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Επιστημονική επιμέλεια · Bergdorf Bioscience
Η ανασύσταση (reconstitution) περιγράφει την ελεγχόμενη διάλυση ενός λυοφιλιωμένου (λυοφιλοποιημένου, freeze-dried) ερευνητικού πεπτιδίου σε έναν κατάλληλο διαλύτη, συνήθως βακτηριοστατικό νερό. Στο εργαστήριο, η ξηρή ουσία αναμειγνύεται με μια καθορισμένη ποσότητα υγρού, ώστε να προκύψει ένα διαυγές διάλυμα με γνωστή συγκέντρωση (mg ανά ml). Η καθαρή, αποστειρωμένη εργασία είναι εδώ καθοριστικής σημασίας, ώστε να αποφεύγεται η επιμόλυνση και η αποικοδόμηση της δραστικής ουσίας.
Τα ερευνητικά πεπτίδια παραδίδονται ως λευκή, χαλαρή σκόνη, επειδή η λυοφιλίωση αφαιρεί το νερό από το υλικό υπό κενό και αφήνει έτσι μια άμορφη σκόνη σταθερή κατά την αποθήκευση. Σε αυτή την ξηρή κατάσταση, οι τυπικές οδοί χημικής αποικοδόμησης, όπως η υδρόλυση, η απαμίδωση και η οξείδωση, εξελίσσονται σημαντικά πιο αργά από ό,τι σε υδατικό διάλυμα (Manning et al., 2010). Η ανασύσταση επαναφέρει αυτή τη σκόνη σε διάλυμα, το οποίο απαιτείται για τον περαιτέρω εργαστηριακό χειρισμό. Μόλις προστεθεί νερό, ωστόσο, αρχίζει να τρέχει το χημικό ρολόι: τα πεπτίδια σε διάλυμα είναι κατά βάση λιγότερο σταθερά από την αρχική τους λυοφιλιωμένη κατάσταση. Στόχος της διαδικασίας είναι, επομένως, μια αναπαραγώγιμη, τεκμηριωμένη συγκέντρωση με ταυτόχρονα ελάχιστη μικροβιακή και μηχανική καταπόνηση. Τυπικές ποσότητες κυμαίνονται από 1 έως 10 mg πεπτιδίου ανά φιαλίδιο (vial), τα οποία διαλύονται με 1 έως 5 ml διαλύτη. Η επιλογή του όγκου καθορίζει άμεσα την τελική συγκέντρωση και θα πρέπει να έχει οριστεί πριν από την πρώτη κίνηση. Όποιος σχεδιάζει εκ των προτέρων τη συγκέντρωση-στόχο, αποφεύγει την κατοπινή επανραίωση, η οποία συνεπάγεται πρόσθετα βήματα πιπετάρισματος και άρα πρόσθετες πηγές σφάλματος. Τα βήματα αυτά νοούνται αποκλειστικά ως εργαστηριακός χειρισμός ερευνητικού υλικού.
Για μια καθαρή ανασύσταση στο εργαστήριο, είναι χρήσιμη μια σύντομη, πλήρης λίστα υλικών, ώστε να μη διακόπτεται η ροή εργασίας. Τα ακόλουθα αντικείμενα ανήκουν στην επιφάνεια εργασίας:
Το λεπτό πάχος βελόνας 29 έως 31 G μειώνει το μέγεθος του σημείου διάτρησης στο ελαστικό πώμα και άρα τον κίνδυνο επιμόλυνσης και απώλειας όγκου. Το βακτηριοστατικό νερό είναι εδώ ο προτιμώμενος διαλύτης, επειδή περιέχει 0,9 τοις εκατό (9 mg ανά ml) βενζυλικής αλκοόλης ως βακτηριοστατικό συντηρητικό και αναστέλλει έτσι τον μικροβιακό πολλαπλασιασμό στο διάλυμα (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Εάν το απόθεμά σας εξαντληθεί, μπορείτε να παραγγείλετε βακτηριοστατικό νερό. Όποιος δεν είναι ακόμη εξοικειωμένος με τα βασικά της κατηγορίας ουσιών, θα βρει μια κατάταξη στον οδηγό Τι είναι τα πεπτίδια;.
Ο κεντρικός τύπος είναι εξαιρετικά απλός: η συγκέντρωση προκύπτει από την ποσότητα πεπτιδίου διά τον προστιθέμενο όγκο νερού, δηλαδή συγκέντρωση (mg ανά ml) ίσον mg πεπτιδίου διά ml νερού. Ένα φιαλίδιο με 5 mg πεπτιδίου, που διαλύεται με 2 ml βακτηριοστατικού νερού, δίνει συνεπώς 2,5 mg ανά ml. Εάν αντ' αυτού προστεθούν 5 ml, η συγκέντρωση πέφτει στο 1 mg ανά ml. Η επιθυμητή συγκέντρωση εξαρτάται από το πόσο λεπτή πρέπει να είναι η μετέπειτα μέτρηση της ποσότητας: μια χαμηλότερη συγκέντρωση σημαίνει μεγαλύτερους προς μέτρηση όγκους και άρα μικρότερη σχετική ανακρίβεια πιπετάρισματος. Επειδή οι σύριγγες ινσουλίνης συχνά είναι διαβαθμισμένες σε μονάδες (100 μονάδες ίσον 1 ml), βοηθάει να επιλέγεται η συγκέντρωση έτσι, ώστε οι απαιτούμενες ποσότητες να πέφτουν σε ευανάγνωστες ενδείξεις μονάδων. Ένα πρακτικό παράδειγμα: στα 2 mg ανά ml, οι 10 μονάδες στη σύριγγα ινσουλίνης αντιστοιχούν ακριβώς σε 0,1 ml και άρα σε 0,2 mg πεπτιδίου. Για να αποφευχθούν λάθη στους υπολογισμούς και να δοκιμαστούν διάφορα σενάρια όγκου, είναι σκόπιμο ένα ψηφιακό βοηθητικό εργαλείο. Ο Υπολογιστής πεπτιδίων αναλαμβάνει τη μετατροπή μεταξύ ποσότητας πεπτιδίου, όγκου νερού και διαβάθμισης της σύριγγας και μειώνει έτσι τον κίνδυνο σφαλμάτων αραίωσης. Σημειώστε την υπολογισμένη συγκέντρωση απευθείας πάνω στο φιαλίδιο, ώστε κάθε μετέπειτα λήψη να παραμένει ιχνηλάσιμη.
Η ίδια η διαδικασία διάλυσης ακολουθεί μια σταθερή σειρά, που προστατεύει τόσο τη στειρότητα όσο και την ακεραιότητα του πεπτιδίου. Προχωρήστε ως εξής:
Η εισαγωγή στο γυάλινο τοίχωμα δεν είναι ένα καλλωπιστικό βήμα, αλλά μειώνει τη μηχανική διατμητική καταπόνηση και τον αφρισμό, ο οποίος στις διεπιφάνειες αέρα-νερού ευνοεί τη συσσωμάτωση (Zapadka et al., 2017). Μια έντονη, απευθείας ροή νερού μπορεί να δημιουργήσει τοπικά υψηλές διατμητικές δυνάμεις και να μετουσιώσει εν μέρει το πεπτίδιο. Η υπομονή είναι εδώ σημαντικότερη από την ταχύτητα. Αυτές οι οδηγίες αναφέρονται αποκλειστικά στον χειρισμό ερευνητικού υλικού στο εργαστήριο.
Μετά την προσθήκη του νερού, συχνά παραμένει αδιάλυτο υλικό στον πυθμένα ή στο τοίχωμα του φιαλιδίου. Ο πειρασμός να ανακινήσει κανείς δυνατά είναι μεγάλος, όμως ακριβώς αυτό είναι αντιπαραγωγικό. Η μηχανική καταπόνηση, όπως η ανακίνηση, η ανάδευση ή η ανάδευση με vortex, αποτελεί στην έρευνα ένα καθιερωμένο μέσο για τη στοχευμένη επιτάχυνση της συσσωμάτωσης πεπτιδίων και πρωτεϊνών (Zapadka et al., 2017). Η ανακίνηση δημιουργεί αμέτρητες μικρές φυσαλίδες αέρα και άρα μια τεράστια αύξηση της διεπιφάνειας αέρα-νερού: αυτή η υδρόφοβη διεπιφάνεια ευνοεί την αναδίπλωση και τη συσσωμάτωση των μορίων πεπτιδίου. Αντί να ανακινήσετε, θα πρέπει να κυλήσετε απαλά το φιαλίδιο μεταξύ αντίχειρα και δείκτη ή να το αναδεύσετε με αργές κυκλικές κινήσεις. Σε καλά διαλυτά πεπτίδια συχνά αρκεί να αφήσετε το φιαλίδιο να ηρεμήσει για λίγα λεπτά μετά την προσθήκη του νερού: η σκόνη διαλύεται τότε από μόνη της. Εάν κάποιο υπόλειμμα δεν διαλύεται, βοηθάει η εκ νέου προσεκτική ανάδευση κατά διαστήματα, ποτέ όμως η έντονη ανακίνηση. Ένα έτοιμο διάλυμα θα πρέπει να είναι διαυγές και απαλλαγμένο από ορατά σωματίδια, θολώματα ή αφρό. Εάν εμφανίζεται θολό ή σχηματίζονται νιφάδες, αυτό υποδηλώνει αρχόμενη συσσωμάτωση ή ατελή διάλυση, και το δείγμα θα πρέπει να αξιολογηθεί κριτικά. Ο ήπιος χειρισμός δεν είναι, λοιπόν, μια λεπτομέρεια, αλλά ένα άμεσο μέτρο προστασίας για την ακεραιότητα του μορίου.
Ο χρόνος διάλυσης εξαρτάται έντονα από την αλληλουχία αμινοξέων, την ποσότητα του πεπτιδίου και την επιλεγμένη συγκέντρωση. Τα καλά υδατοδιαλυτά, υδρόφιλα πεπτίδια συχνά διαλύονται πλήρως μέσα σε λίγα λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, μόλις προστεθεί το νερό κατά μήκος του τοιχώματος και αναδευτεί απαλά το φιαλίδιο. Αλληλουχίες με υψηλό ποσοστό υδρόφοβων αμινοξέων, όπως λευκίνη, βαλίνη, φαινυλαλανίνη ή τρυπτοφάνη, διαλύονται πιο αργά και ενίοτε χρειάζονται 15 έως 30 λεπτά ή επαναλαμβανόμενη απαλή ανάδευση ανά διαστήματα μερικών λεπτών. Σημαντικό είναι να δίνει κανείς χρόνο στη διαδικασία, αντί να επιχειρεί να βοηθήσει με μηχανική βία. Η επιταχυνόμενη διάλυση μέσω θέρμανσης δεν συνιστάται, καθώς οι αυξημένες θερμοκρασίες ενισχύουν ταυτόχρονα πολλαπλές οδούς αποικοδόμησης: η απαμίδωση και η υδρόλυση επιταχύνονται με την αύξηση της θερμοκρασίας, ενώ και η φυσική συσσωμάτωση παρουσιάζει έντονη εξάρτηση από τη θερμοκρασία (Manning et al., 2010). Εάν μετά από 30 λεπτά και πολλαπλά διαστήματα ανάδευσης παραμένει ορατά αδιάλυτο υλικό, ο όγκος μπορεί να αυξηθεί ελαφρά για να μειωθεί η συγκέντρωση, ή το δείγμα τεκμηριώνεται ως ατελώς διαλυμένο. Ένα πλήρως ανασυσταμένο διάλυμα είναι οπτικά διαυγές: κάθε μόνιμο θόλωμα θα πρέπει να εκλαμβάνεται ως προειδοποιητικό σήμα. Συμπεριλάβετε από την αρχή στη ροή του πειράματός σας ένα χρονικό περιθώριο για τη διάλυση.
Μόλις το πεπτίδιο βρεθεί σε διάλυμα, η σταθερότητά του μειώνεται σημαντικά, και οι συνθήκες αποθήκευσης γίνονται ο καθοριστικός παράγοντας. Το ανασυσταμένο διάλυμα θα πρέπει να φυλάσσεται δροσερό, σκοτεινό και καλά σφραγισμένο, συνήθως στο ψυγείο στους 2 έως 8 βαθμούς Κελσίου. Η περιεχόμενη βενζυλική αλκοόλη του βακτηριοστατικού νερού αναστέλλει την ανάπτυξη βακτηρίων και παρατείνει έτσι το αξιοποιήσιμο χρονικό διάστημα του ανοιγμένου διαλύματος, δεν αντικαθιστά όμως μια καθαρή μέθοδο εργασίας (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Για τη μακροπρόθεσμη φύλαξη, η κατάψυξη είναι μια επιλογή, ωστόσο με έναν σημαντικό περιορισμό: κάθε κύκλος κατάψυξης-απόψυξης καταπονεί το πεπτίδιο μηχανικά και χημικά. Μελέτες σε πρωτεϊνικά διαλύματα δείχνουν ότι κάθε πρόσθετος κύκλος κατάψυξης-απόψυξης αυξάνει τον αριθμό των σωματιδίων και άρα τον σχηματισμό συσσωματωμάτων στο δείγμα (Hauptmann et al., 2018). Η πρακτική συνέπεια είναι η εξής: χωρίστε το διάλυμα πριν από την κατάψυξη σε μικρά κλάσματα μίας χρήσης (aliquots), ώστε για κάθε χρήση να αποψύχεται μόνο ένα κλάσμα και να μην απαιτείται επαναλαμβανόμενη κατάψυξη. Προστατεύστε επιπλέον τα φιαλίδια από το φως και σημειώστε σε καθένα τη συγκέντρωση και την ημερομηνία. Κατά την απόψυξη συνιστάται αργή θέρμανση στο ψυγείο αντί σε ζεστό υδατόλουτρο, ώστε να αποφεύγονται τα θερμικά σοκ. Όποιος τηρεί αυτούς τους κανόνες, διατηρεί χαμηλή την αποικοδόμηση καθ' όλη τη διάρκεια χρήσης.
Η προστασία από επιμόλυνση δεν ξεκινά μόλις κατά τη διάτρηση, αλλά ήδη κατά την προετοιμασία της επιφάνειας εργασίας. Καθαρίστε τον χώρο εργασίας, τοποθετήστε όλα τα υλικά σε πρόχειρη θέση και απολυμάνετε κάθε ελαστικό πώμα πριν από κάθε μεμονωμένη διάτρηση με ένα φρέσκο τολύπιο αλκοόλης (70 τοις εκατό ισοπροπανόλη), το οποίο αφήνετε να στεγνώσει για λίγο. Χρησιμοποιήστε για κάθε λήψη μια αποστειρωμένη βελόνα και αποφύγετε να περνάτε την ίδια βελόνα επανειλημμένα μέσα από διαφορετικά πώματα, καθώς αυτό μπορεί να μεταφέρει μικρόβια. Μην αγγίζετε ποτέ τη μύτη της βελόνας ή τον κώνο της σύριγγας με τα δάχτυλα. Το συντηρητικό βενζυλική αλκοόλη αναστέλλει μεν την ανάπτυξη βακτηρίων, όμως αυτή η προστασία είναι περιορισμένη και δεν αποτελεί ελεύθερη άδεια για ακάθαρτη εργασία: μια βακτηριοστατική δράση δεν σκοτώνει τα υπάρχοντα μικρόβια, αλλά απλώς καθυστερεί τον πολλαπλασιασμό τους (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι η βενζυλική αλκοόλη δεν είναι ακίνδυνη: ιστορικά συνδέθηκε σε πρόωρα νεογνά με το λεγόμενο σύνδρομο gasping, μια σοβαρή τοξική αντίδραση λόγω υψηλής έκθεσης σε βενζυλική αλκοόλη (Gershanik et al., 1982). Αυτό υπογραμμίζει ότι το βακτηριοστατικό νερό είναι ένα εργαστηριακό αντιδραστήριο με δικό του προφίλ ασφαλείας και χρησιμοποιείται αποκλειστικά για τον χειρισμό ερευνητικού υλικού. Τεκμηριώστε κάθε λήψη, ώστε να διατηρείται ιχνηλάσιμη η ακεραιότητα του δείγματος καθ' όλη τη διάρκεια χρήσης του.
Πολλά προβλήματα κατά την ανασύσταση μπορούν να αναχθούν σε έναν μικρό αριθμό επαναλαμβανόμενων λαθών, που μπορούν να αποφευχθούν με λίγη προσοχή. Τα συχνότερα είναι:
Όποιος επεξεργάζεται συστηματικά αυτά τα σημεία, λαμβάνει αναπαραγώγιμα διαυγή διαλύματα με τεκμηριωμένη συγκέντρωση. Μια σύντομη λίστα ελέγχου στην επιφάνεια εργασίας βοηθάει να μην παραλείπεται κανένα βήμα, ιδιαίτερα όταν επεξεργάζονται πολλά φιαλίδια σε σειρά. Ο συνδυασμός σωστού υπολογισμού ποσότητας, ήπιου χειρισμού και συνεπούς στειρότητας αποτελεί το θεμέλιο κάθε καθαρού εργαστηριακού χειρισμού ερευνητικών πεπτιδίων.
Στο εργαστήριο χρησιμοποιείται συνήθως βακτηριοστατικό νερό, καθώς η περιεκτικότητά του σε 0,9 τοις εκατό βενζυλική αλκοόλη αναστέλλει τον μικροβιακό πολλαπλασιασμό στο ανοιγμένο διάλυμα. Για ορισμένες υδρόφοβες ή δυσδιάλυτες αλληλουχίες μπορεί να χρειαστούν αποκλίνοντες διαλύτες. Η επιλογή θα πρέπει πάντα να προσανατολίζεται στο προφίλ διαλυτότητας του εκάστοτε πεπτιδίου.
Η συγκέντρωση προκύπτει από mg πεπτιδίου διά ml νερού. Ένα φιαλίδιο των 5 mg με 2 ml νερού δίνει 2,5 mg ανά ml. Ο Υπολογιστής πεπτιδίων αναλαμβάνει αυτή τη μετατροπή μαζί με τη διαβάθμιση της σύριγγας ινσουλίνης και μειώνει τα σφάλματα στους υπολογισμούς.
Η ανακίνηση δημιουργεί πολλές φυσαλίδες αέρα και μεγεθύνει τη διεπιφάνεια αέρα-νερού, στην οποία τα πεπτίδια συσσωματώνονται ευκολότερα. Το απαλό κύλισμα ή η ήπια ανάδευση διαλύει εξίσου τη σκόνη, αλλά προστατεύει τη μοριακή δομή. Η μηχανική καταπόνηση χρησιμοποιείται μάλιστα σε μελέτες στοχευμένα για την επιτάχυνση της συσσωμάτωσης.
Σε διάλυμα, τα πεπτίδια είναι σαφώς λιγότερο σταθερά από ό,τι ως σκόνη. Ένα ψυχόμενο διάλυμα (2 έως 8 βαθμοί Κελσίου) θα πρέπει να χρησιμοποιείται γρήγορα: για μακρύτερη φύλαξη καταψύχεται σε κλάσματα μίας χρήσης (aliquots), ώστε να αποφεύγονται οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι κατάψυξης-απόψυξης. Το ακριβές προφίλ εξαρτάται από την αλληλουχία.
Μόνο για ερευνητικούς σκοπούς. Δεν προορίζεται για ανθρώπινη κατανάλωση. Επιστημονική επιμέλεια: Dr. Sieglinde Klaus
