Kako ispravno čitati HPLC čistoću i CoA peptida
Dr. Sieglinde Klaus
Znanstvena redakcija · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Znanstvena redakcija · Bergdorf Bioscience
HPLC čistoća pokazuje koliki postotak ukupne površine kromatograma otpada na ciljani peptid, dok Certificate of Analysis (CoA, analitički certifikat) tu vrijednost dokumentira zajedno s identitetom potvrđenim masenom spektrometrijom, oznakom serije i primijenjenim metodama ispitivanja. Vrijednost od >=99% znači da u signalu UV-detektora samo vrlo mali dio površine otpada na sporedne komponente. Ovaj vodič objašnjava kako nastaju oba podatka i kako ih sami možete provjeriti.
Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC) razdvaja otopljenu peptidnu smjesu prema fizikalno-kemijskim svojstvima i tako čini vidljivim od koliko se komponenata uzorak sastoji. U analitici peptida prevladava HPLC s obrnutom fazom (RP-HPLC) na kolonama C18, C8 ili C4, jer razdvaja molekule prema njihovoj hidrofobnosti i pritom postiže visoku razlučivost. Prema metodičkom pregledu autora Mant et al., 2007 HPLC se već više od 25 godina smatra najuniverzalnijim postupkom za izolaciju i određivanje čistoće sintetskih peptida.
Konkretno, kroz kolonu protječe mobilna faza, najčešće gradijent vode i acetonitrila s 0,05 do 0,1% trifluoroctene kiseline (TFA). Svaka komponenta napušta kolonu u karakterističnom trenutku, takozvanom retencijskom vremenu, i na UV-detektoru (tipično 214 ili 220 nm, gdje peptidna veza apsorbira) stvara pik. HPLC dakle ne mjeri identitet neke tvari, nego njezino ponašanje pri razdvajanju i relativni udio količine. Za izjavu o identitetu potrebna je druga metoda: masena spektrometrija.
Postotni podatak o HPLC čistoći opisuje udio površine glavnog pika u ukupnoj površini svih detektiranih pikova. Pri 99% na ciljani peptid otpada 99% integrirane površine UV-signala, a samo 1% na sve sporedne komponente zajedno. Važno je da je riječ o relativnom podatku o površini, a ne o podatku o masi: ostatci otapala, soli ili voda, koji pri 214 nm gotovo i ne apsorbiraju, ne ulaze u tu vrijednost. Zato ozbiljni proizvođači HPLC čistoću nadopunjuju dodatnim pokazateljima poput neto sadržaja peptida.
Sporedne komponente najčešće potječu iz sinteze na čvrstoj fazi. Prema Boysen & Hearn, 2006 pri postupnoj sintezi nastaju ponajprije delecijske sekvence (s jednom aminokiselinom koja nedostaje), skraćene sekvence te produkti nepotpunog uklanjanja zaštitnih skupina ili racemizacije. Upravo te kemijski vrlo slične nečistoće teško je odvojiti i one određuju koliko visoka čistoća je dostižna. Skok s 95% na 99% stoga znači da su ti srodni produkti uglavnom uklonjeni. Više pozadinskih informacija o samoj skupini tvari pronaći ćete u vodiču Što su peptidi?.
CoA je protokol ispitivanja konkretne serije i objedinjuje rezultate svih provedenih analiza u jednom dokumentu. Tipično navodi naziv proizvoda, sumarnu formulu i teoretsku molekulsku masu, broj serije, datum proizvodnje ili ispitivanja te primijenjene metode. Srž čine dva bloka: potvrda identiteta masenom spektrometrijom i određivanje čistoće HPLC-om. Često su dodatno navedeni i nalaz izgleda (bijeli liofilizat) te sadržaj vode.
Presudno je da pouzdan CoA prikazuje izvorne podatke, a ne samo tvrdi neku brojku. To uključuje prikazani HPLC kromatogram s retencijskim vremenom i integracijskim površinama te maseni spektar s izmjerenom m/z vrijednošću. Tako stručna osoba može provjeriti navode, umjesto da im samo vjeruje. Podaci o metodi trebali bi biti precizni, primjerice tip kolone, gradijent, valna duljina detekcije i upotrijebljeni postupak ionizacije. U tvrtki BergdorfBio CoA vezan uz seriju služi kao dokaz za jamstvo >=99% HPLC čistoće i CoA navedeno na početnoj stranici. Proizvodi poput BPC-157 ili Retatrutida isporučuju se svaki s takvim dokumentom za odgovarajuću seriju.
Dok HPLC pokazuje samo ponašanje pri razdvajanju, masena spektrometrija odgovara na pitanje je li prisutna prava molekula. U analitici peptida prevladava ionizacija elektroraspršenjem (ESI), blagi postupak ionizacije koji molekule prevodi u plinovitu fazu bez fragmentacije. Prema Banerjee & Mazumdar, 2012 ESI stvara višestruko nabijene ione, čime se mjerljivo m/z područje znatno proširuje, pa se i veliki peptidi mogu precizno odrediti.
Na CoA se izmjerena molekulska masa uspoređuje s teoretskom vrijednošću izračunatom iz sumarne formule. Ako se obje podudaraju do na nekoliko jedinica mase, identitet peptida je potvrđen. Odstupanje od primjerice 18 jedinica mase moglo bi upućivati na gubitak vode, a veća razlika na pogrešnu ili onečišćenu sekvencu. Sprega obiju metoda, dakle LC-MS, posebno je informativna: Toll et al., 2005 pokazali su da se preko 50 peptida triptičke razgradnje može razdvojiti u 15 do 20 minuta i istodobno identificirati ESI-MS-om. Identitet i čistoća tako se utvrđuju u jednom prolazu.
Kromatogram je grafička srž svakog CoA: na osi x nalazi se vrijeme u minutama, a na osi y odgovor detektora, najčešće u miliapsorpcijskim jedinicama (mAU). Ciljani peptid pojavljuje se kao visok, uzak glavni pik u svom karakterističnom retencijskom vremenu, primjerice pri 8 do 12 minuta ovisno o metodi. Uredno obrađen uzorak pokazuje jedan, oštar i simetričan pik s jasnim odvajanjem od bazne linije u odnosu na eventualne sporedne pikove.
Pri čitanju obratite pažnju na tri stvari. Prvo, oblik pika: jako iskrivljen pik (engl. tailing) ili proširena baza mogu upućivati na koeluirajuće nečistoće ili probleme s kolonom. Drugo, mali sporedni pikovi: oni predstavljaju nusprodukte sinteze; zbroj njihovih površina daje postotak koji nedostaje do oznake od 100%. Treće, bazna linija: trebala bi teći ravno i mirno, bez drifta. Integracija, dakle računsko određivanje površine ispod svakog pika, na kraju daje postotne vrijednosti. Mobilna faza koja sadrži TFA pritom poboljšava oštrinu pika, jer TFA kao reagens za stvaranje ionskih parova maskira bazične bočne lance peptida i tako stvara jednoličnije ponašanje pri eluciji (Mant et al., 2007).
Pojedinačni postotni podatak bez konteksta malo vrijedi jer ovisi o metodi. Isti uzorak može na dvije različite kolone ili pri dvije valne duljine detekcije dati blago različite vrijednosti, jer razdvajanje i UV-apsorpcija sporednih komponenata variraju. Čistoća od 99%, izmjerena pri samo jednoj valnoj duljini, uvjerljiva je tek kada je metoda potpuno dokumentirana i kada je priložen pripadajući kromatogram. Goli broj bez spektra nije moguće provjeriti.
Tome se pridodaje da HPLC čistoća ne obuhvaća UV-neaktivne sastojke. Soli iz postupka sinteze i pročišćavanja, primjerice acetatni ili trifluoroacetatni protuioni, te zaostala voda, doprinose masi a da se ne pojavljuju u kromatogramu. Zato je neto sadržaj peptida, često određen analizom aminokiselina ili određivanjem dušika, smislena nadopuna: govori koliko je čistog peptida po miligramu praška zapravo sadržano. Identitet (MS), relativna čistoća (HPLC) i apsolutni sadržaj tri su različita pitanja na koja dobar CoA odgovara zasebno.
Svaka serija sinteze vlastiti je kemijski proces s vlastitim oscilacijama, zbog čega CoA uvijek mora biti pridružen konkretnoj seriji. Generički podatkovni list, koji bi navodno trebao vrijediti za sve ikada proizvedene jedinice nekog proizvoda, nije dokaz ispitivanja, nego reklamna tvrdnja. Tek broj serije na dokumentu povezuje izmjerene vrijednosti s fizičkim materijalom u bočici pred vama. Retencijsko vrijeme, maseni spektar i čistoća vrijede točno za tu proizvodnu jedinicu.
To je važno i zato što se profil nečistoća može razlikovati među serijama. Jedna serija možda postiže 99,2%, druga 98,6% s malo drukčijim uzorkom sporednih pikova. Samo CoA vezan uz seriju odražava tu stvarnost. Praktično, broj serije na naljepnici trebali biste usporediti s onim na CoA, provjeriti datum ispitivanja i uvjeriti se da je kromatogram doista priložen. Ako nedostaje veza sa serijom ili izvorni podatkovni list, podatak o čistoći nije moguće provjeriti, bez obzira na to koliko je broj visok.
Mali pikovi pokraj glavnog pika nisu slučajni, nego imaju definirane kemijske uzroke. Iz sinteze na čvrstoj fazi potječu ponajprije delecijski peptidi, kod kojih je tijekom izgradnje izostavljena jedna aminokiselina, te skraćene sekvence zbog preuranjenog prekida lanca. Uz to se javljaju produkti nepotpunog uklanjanja zaštitnih skupina, kod kojih zaštitne skupine ostaju na molekuli, te racemizacijski produkti s promijenjenom stereokemijom. Ti srodni produkti često se samo minimalno razlikuju od ciljanog peptida i sukladno tome eluiraju blizu glavnog pika.
Nakon skladištenja mogu se pridodati i drugi produkti razgradnje. Prema pregledu autora Lai & Topp, 1999 u najvažnije kemijske reakcije u čvrstom stanju ubrajaju se deamidacija, cijepanje peptidne veze, oksidacija, Maillardova reakcija, beta-eliminacija i agregacija. U kromatogramu se takvi procesi očituju kao novi ili rastući sporedni pikovi. CoA izrađen neposredno nakon sinteze stoga dokumentira početno stanje; stvarni profil u istraživačkom laboratoriju dodatno ovisi o rukovanju i skladištenju.
Čistoća dokumentirana na CoA vrijedi za trenutak mjerenja, najčešće neposredno nakon sinteze i pročišćavanja. Istraživački peptidi zato se gotovo uvijek isporučuju kao liofilizat, dakle kao smrznuto i osušeno (liofilizirano) praškasto sredstvo, jer uklanjanje vode znatno usporava hidrolitičke i oksidacijske putove razgradnje. Prema Lai & Topp, 1999 kemijsku stabilnost u čvrstom stanju ponajviše određuju temperatura, zaostala vlaga i agregatno stanje; već i mala zaostala vlaga može ubrzati agregaciju.
To u praksi znači: i najljepši podatak od 99% malo koristi ako se materijal potom nepravilno skladišti. Hladno, suho i od svjetla zaštićeno čuvanje zatvorenog liofilizata najdulje održava profil dokumentiran na CoA. Kada se peptid rekonstituira, dakle prevede u otopinu, reakcije razgradnje ovisne o vodi počinju teći brže, a izvorni kromatogram gubi valjanost. Tko želi ispravno tumačiti podatke o čistoći, mora stoga razlikovati trenutak mjerenja od trenutka uporabe: CoA opisuje stanje pri isporuci, a ne trajno stanje kroz cijelo razdoblje uporabe.
Sustavna provjera traje samo nekoliko minuta i apstraktne vrijednosti čini opipljivima. Prođite kroz dokument ovim redoslijedom:
Ako neki od tih podataka nedostaje, CoA je nepotpun. Posebno je kritičan izostanak izvornih grafika: bez kromatograma i spektra broj čistoće ostaje puka tvrdnja. Potpun dokument vezan uz seriju sa svim sirovim podacima, naprotiv, najjači je signal kvalitete koji istraživački peptid može imati. Omogućuje vam da sami provjerite navode, umjesto da se oslanjate na izoliranu brojku.
HPLC čistoća je relativni podatak o površini i govori koji udio UV-aktivnih sastojaka otpada na ciljani peptid. Sadržaj peptida pak pokazuje koliko je čistog peptida sadržano po miligramu ukupnog praška te uzima u obzir i UV-neaktivne sastojke poput soli i zaostale vode. Obje se vrijednosti nadopunjuju i treba ih promatrati zasebno.
Ne automatski, jer broj ovisi o metodi. Dokumentirani kromatogram pri 98% može biti informativniji od golog podatka od 99% bez izvornih podataka. Presudno je da je čistoća potkrijepljena provjerljivim kromatogramom vezanim uz seriju i da je metoda mjerenja jasno navedena.
HPLC razdvaja samo prema fizikalno-kemijskim svojstvima i pokazuje ponašanje pri razdvajanju, a ne molekulski sastav. Dvije različite molekule mogle bi teoretski slično eluirati. Tek masena spektrometrija mjeri molekulsku masu i usporedbom s teoretskom vrijednošću potvrđuje da je doista prisutan ciljani peptid.
CoA dokumentira stanje u trenutku ispitivanja, najčešće neposredno nakon sinteze. On ostaje valjan kao dokaz podrijetla, ali ne opisuje stanje nakon dugog ili nepravilnog skladištenja. Pripazite na naveden datum ispitivanja i imajte na umu da stvarna čistoća ovisi o uvjetima skladištenja.
Samo za istraživačke svrhe. Nije namijenjeno za ljudsku konzumaciju. Znanstveno uredništvo: Dr. Sieglinde Klaus
