Καθαρότητα HPLC και CoA πεπτιδίων: σωστή ανάγνωση
Dr. Sieglinde Klaus
Επιστημονική επιμέλεια · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Επιστημονική επιμέλεια · Bergdorf Bioscience
Η καθαρότητα HPLC δηλώνει ποιο ποσοστιαίο τμήμα της επιφάνειας ενός χρωματογραφήματος αντιστοιχεί στο πεπτίδιο-στόχο, ενώ το Πιστοποιητικό Ανάλυσης (Certificate of Analysis, CoA) τεκμηριώνει αυτή την τιμή μαζί με την ταυτότητα που επιβεβαιώνεται μέσω φασματομετρίας μάζας, την παρτίδα και τις μεθόδους ελέγχου. Μια τιμή >=99% σημαίνει ότι στο σήμα του ανιχνευτή UV μόνο μια πολύ μικρή επιφάνεια αντιστοιχεί σε δευτερεύοντα συστατικά. Αυτός ο οδηγός εξηγεί πώς προκύπτουν και τα δύο αυτά στοιχεία και πώς μπορείτε να τα ελέγξετε.
Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) διαχωρίζει ένα διαλυμένο μείγμα πεπτιδίων σύμφωνα με φυσικοχημικές ιδιότητες και καθιστά έτσι ορατό από πόσα συστατικά αποτελείται ένα δείγμα. Στην αναλυτική των πεπτιδίων κυριαρχεί η HPLC αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) σε στήλες C18, C8 ή C4, επειδή διαχωρίζει τα μόρια ανάλογα με την υδροφοβικότητά τους παρέχοντας παράλληλα υψηλή διαχωριστική ικανότητα. Σύμφωνα με τη μεθοδολογική ανασκόπηση των Mant et al., 2007, η HPLC θεωρείται εδώ και πάνω από 25 χρόνια η πιο ευέλικτη μέθοδος για την απομόνωση και τον προσδιορισμό της καθαρότητας συνθετικών πεπτιδίων.
Συγκεκριμένα, μια κινητή φάση, συνήθως μια διαβάθμιση από νερό και ακετονιτρίλιο με 0,05 έως 0,1% τριφθοροξικό οξύ (TFA), διέρχεται μέσα από τη στήλη. Κάθε συστατικό εγκαταλείπει τη στήλη σε μια χαρακτηριστική χρονική στιγμή, τον χρόνο κατακράτησης, και παράγει στον ανιχνευτή UV (τυπικά στα 214 ή 220 nm, όπου απορροφά ο πεπτιδικός δεσμός) μια κορυφή. Η HPLC δεν μετρά λοιπόν την ταυτότητα μιας ουσίας, αλλά τη συμπεριφορά διαχωρισμού της και τη σχετική της αναλογία ποσότητας. Για μια δήλωση ταυτότητας χρειάζεται μια δεύτερη μέθοδος, η φασματομετρία μάζας.
Η ποσοστιαία τιμή της καθαρότητας HPLC περιγράφει το τμήμα της επιφάνειας της κύριας κορυφής επί της συνολικής επιφάνειας όλων των ανιχνευόμενων κορυφών. Στο 99% αντιστοιχεί επομένως το 99% της ολοκληρωμένης επιφάνειας του σήματος UV στο πεπτίδιο-στόχο και μόνο το 1% στο σύνολο όλων των δευτερευόντων συστατικών. Είναι σημαντικό ότι πρόκειται για σχετική δήλωση επιφάνειας και όχι για δήλωση βάρους: υπολείμματα διαλυτών, άλατα ή νερό, που στα 214 nm απορροφούν ελάχιστα, δεν συνυπολογίζονται σε αυτή την τιμή. Γι' αυτό οι σοβαροί κατασκευαστές συμπληρώνουν την καθαρότητα HPLC με επιπλέον δείκτες, όπως την καθαρή περιεκτικότητα σε πεπτίδιο.
Τα δευτερεύοντα συστατικά προέρχονται συνήθως από τη σύνθεση στερεάς φάσης. Σύμφωνα με τους Boysen & Hearn, 2006, κατά τη βηματική σύνθεση προκύπτουν κυρίως αλληλουχίες έλλειψης (μια αμινοξύ που λείπει), βραχυσμένες αλληλουχίες, καθώς και προϊόντα ατελούς αποπροστασίας ή ρακεμίωσης. Ακριβώς αυτές οι χημικά πολύ παρόμοιες προσμείξεις είναι δύσκολο να διαχωριστούν και καθορίζουν πόσο υψηλή θα είναι η επιτεύξιμη καθαρότητα. Ένα άλμα από το 95% στο 99% σημαίνει επομένως ότι αυτές οι συγγενικές ενώσεις απομακρύνθηκαν σε μεγάλο βαθμό. Περισσότερο υπόβαθρο για την ίδια την κατηγορία ουσιών θα βρείτε στον οδηγό Τι είναι τα πεπτίδια;.
Ένα CoA είναι το πρωτόκολλο ελέγχου μιας συγκεκριμένης παρτίδας και συγκεντρώνει τα αποτελέσματα όλων των αναλύσεων που πραγματοποιήθηκαν σε ένα έγγραφο. Τυπικά αναφέρει την ονομασία του προϊόντος, τον μοριακό τύπο και το θεωρητικό μοριακό βάρος, τον αριθμό παρτίδας, την ημερομηνία παρασκευής ή ελέγχου, καθώς και τις εφαρμοζόμενες μεθόδους. Τον πυρήνα αποτελούν δύο ενότητες: η επιβεβαίωση ταυτότητας μέσω φασματομετρίας μάζας και ο προσδιορισμός καθαρότητας μέσω HPLC. Συχνά αναφέρονται επιπλέον το πόρισμα εμφάνισης (λευκό λυοφιλοποιημένο προϊόν) και η περιεκτικότητα σε νερό.
Καθοριστικό είναι ότι ένα αξιόπιστο CoA δείχνει τα πρωτογενή δεδομένα και δεν δηλώνει απλώς έναν αριθμό. Σε αυτά ανήκουν το απεικονιζόμενο χρωματογράφημα HPLC με τον χρόνο κατακράτησης και τις επιφάνειες ολοκλήρωσης, καθώς και το φάσμα μάζας με τη μετρηθείσα τιμή m/z. Έτσι ένα ειδικευμένο άτομο μπορεί να κατανοήσει τις δηλώσεις, αντί απλώς να τις πιστέψει. Τα στοιχεία της μεθόδου θα πρέπει να είναι ακριβή, για παράδειγμα ο τύπος στήλης, η διαβάθμιση, το μήκος κύματος ανίχνευσης και η χρησιμοποιούμενη μέθοδος ιονισμού. Στην BergdorfBio το CoA που αφορά την παρτίδα χρησιμεύει ως απόδειξη για τη δέσμευση HPLC και CoA >=99% που αναφέρεται στην αρχική σελίδα. Προϊόντα όπως το BPC-157 ή η Ρετατρουτίδη παραδίδονται καθένα με ένα τέτοιο έγγραφο για την παρτίδα.
Ενώ η HPLC δείχνει μόνο τη συμπεριφορά διαχωρισμού, η φασματομετρία μάζας απαντά στο ερώτημα αν υπάρχει το σωστό μόριο. Στην αναλυτική των πεπτιδίων κυριαρχεί ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό (ESI), μια ήπια μέθοδος ιονισμού που μεταφέρει τα μόρια στην αέρια φάση χωρίς θρυμματισμό. Σύμφωνα με τους Banerjee & Mazumdar, 2012, ο ESI παράγει πολλαπλά φορτισμένα ιόντα, με αποτέλεσμα να διευρύνεται σημαντικά το μετρήσιμο εύρος m/z και να μπορούν να προσδιοριστούν με ακρίβεια ακόμη και μεγάλα πεπτίδια.
Στο CoA το μετρηθέν μοριακό βάρος αντιπαραβάλλεται με τη θεωρητική τιμή που υπολογίζεται από τον μοριακό τύπο. Αν και τα δύο συμφωνούν σε λίγες μονάδες μάζας, η ταυτότητα του πεπτιδίου επιβεβαιώνεται. Μια απόκλιση, για παράδειγμα, 18 μονάδων μάζας θα μπορούσε να υποδηλώνει απώλεια νερού, ενώ μια μεγαλύτερη διαφορά μια λανθασμένη ή μολυσμένη αλληλουχία. Η σύζευξη και των δύο μεθόδων, δηλαδή η LC-MS, είναι ιδιαίτερα διαφωτιστική: οι Toll et al., 2005 έδειξαν ότι περισσότερα από 50 πεπτίδια μιας θρυψινικής πέψης μπορούν να διαχωριστούν σε 15 έως 20 λεπτά και να ταυτοποιηθούν ταυτόχρονα μέσω ESI-MS. Η ταυτότητα και η καθαρότητα καταγράφονται έτσι σε μία ανάλυση.
Το χρωματογράφημα είναι η γραφική κεντρική δήλωση κάθε CoA: στον άξονα x βρίσκεται ο χρόνος σε λεπτά, στον άξονα y η απόκριση του ανιχνευτή, συνήθως σε μονάδες χιλιοστοαπορρόφησης (mAU). Το πεπτίδιο-στόχος εμφανίζεται ως υψηλή, στενή κύρια κορυφή στον χαρακτηριστικό του χρόνο κατακράτησης, περίπου στα 8 έως 12 λεπτά ανάλογα με τη μέθοδο. Ένα καθαρά επεξεργασμένο δείγμα δείχνει μία μόνο, αιχμηρή και συμμετρική κορυφή με σαφή διαχωρισμό γραμμής βάσης από τυχόν δευτερεύουσες κορυφές.
Κατά την ανάγνωση προσέξτε τρία πράγματα. Πρώτον, το σχήμα της κορυφής: μια έντονα ασύμμετρη κορυφή (tailing) ή μια διευρυμένη βάση μπορεί να υποδηλώνει συνεκλουόμενες προσμείξεις ή προβλήματα στη στήλη. Δεύτερον, τις μικρές δευτερεύουσες κορυφές: αυτές αντιστοιχούν σε παραπροϊόντα της σύνθεσης, και το άθροισμα της επιφάνειάς τους δίνει το ποσοστιαίο τμήμα που λείπει για να φτάσει το όριο του 100%. Τρίτον, τη γραμμή βάσης: θα πρέπει να εξελίσσεται επίπεδη και ομαλή, χωρίς ολίσθηση (drift). Η ολοκλήρωση, δηλαδή ο υπολογιστικός προσδιορισμός της επιφάνειας κάτω από κάθε κορυφή, δίνει τελικά τους αριθμούς των ποσοστών. Μια κινητή φάση που περιέχει TFA βελτιώνει παράλληλα την αιχμηρότητα της κορυφής, καθώς το TFA ως αντιδραστήριο σχηματισμού ιοντικών ζευγών καλύπτει τις βασικές πλευρικές αλυσίδες του πεπτιδίου παράγοντας έτσι μια πιο ομοιογενή συμπεριφορά έκλουσης (Mant et al., 2007).
Μια μεμονωμένη ποσοστιαία τιμή χωρίς πλαίσιο έχει μικρή αξία, επειδή εξαρτάται από τη μέθοδο. Το ίδιο δείγμα μπορεί να δώσει σε δύο διαφορετικές στήλες ή σε δύο μήκη κύματος ανίχνευσης ελαφρώς διαφορετικές τιμές, καθώς ο διαχωρισμός και η απορρόφηση UV των δευτερευόντων συστατικών μεταβάλλονται. Μια καθαρότητα 99%, μετρημένη σε ένα μόνο μήκος κύματος, πείθει μόνο όταν η μέθοδος είναι πλήρως τεκμηριωμένη και το αντίστοιχο χρωματογράφημα επισυνάπτεται. Ένας γυμνός αριθμός χωρίς φάσμα δεν μπορεί να ελεγχθεί.
Σε αυτό προστίθεται ότι η καθαρότητα HPLC δεν καταγράφει τα συστατικά που είναι ανενεργά στο UV. Άλατα από τη διαδικασία σύνθεσης και καθαρισμού, για παράδειγμα αντισταθμιστικά ιόντα οξικού ή τριφθοροξικού, καθώς και υπολειπόμενο νερό, προσθέτουν μάζα χωρίς να εμφανίζονται στο χρωματογράφημα. Γι' αυτό η καθαρή περιεκτικότητα σε πεπτίδιο, που συχνά προσδιορίζεται μέσω ανάλυσης αμινοξέων ή προσδιορισμού αζώτου, αποτελεί χρήσιμη συμπλήρωση: δηλώνει πόσο καθαρό πεπτίδιο περιέχεται πραγματικά ανά χιλιοστόγραμμο σκόνης. Η ταυτότητα (MS), η σχετική καθαρότητα (HPLC) και η απόλυτη περιεκτικότητα είναι τρία διαφορετικά ερωτήματα, στα οποία ένα καλό CoA απαντά ξεχωριστά.
Κάθε σειρά σύνθεσης είναι μια ξεχωριστή χημική διαδικασία με τις δικές της διακυμάνσεις, γι' αυτό ένα CoA πρέπει πάντα να αντιστοιχεί σε μια συγκεκριμένη παρτίδα. Ένα γενικό φύλλο δεδομένων, που υποτίθεται ότι ισχύει για όλες τις μονάδες ενός προϊόντος που παρήχθησαν ποτέ, δεν είναι απόδειξη ελέγχου, αλλά διαφημιστική δήλωση. Μόνο ο αριθμός παρτίδας στο έγγραφο συνδέει τις μετρηθείσες τιμές με το φυσικό υλικό στο φιαλίδιο μπροστά σας. Ο χρόνος κατακράτησης, το φάσμα μάζας και η καθαρότητα ισχύουν ακριβώς για αυτή τη μονάδα παραγωγής.
Αυτό είναι σημαντικό και επειδή το προφίλ των προσμείξεων μπορεί να διαφέρει μεταξύ των παρτίδων. Μια παρτίδα φτάνει ίσως το 99,2%, μια άλλη το 98,6% με ένα ελαφρώς διαφορετικό μοτίβο δευτερευουσών κορυφών. Μόνο ένα CoA συνδεδεμένο με την παρτίδα αποτυπώνει αυτή την πραγματικότητα. Πρακτικά, θα πρέπει να αντιπαραβάλλετε τον αριθμό παρτίδας στην ετικέτα με αυτόν στο CoA, να ελέγχετε την ημερομηνία ελέγχου και να βεβαιώνεστε ότι το χρωματογράφημα όντως επισυνάπτεται. Αν λείπει η αναφορά στην παρτίδα ή το πρωτότυπο φύλλο δεδομένων, η δήλωση καθαρότητας δεν είναι ελέγξιμη, ανεξάρτητα από το πόσο υψηλός είναι ο αριθμός.
Οι μικρές κορυφές δίπλα στην κύρια κορυφή δεν είναι τυχαίες, αλλά έχουν καθορισμένες χημικές αιτίες. Από τη σύνθεση στερεάς φάσης προέρχονται κυρίως πεπτίδια έλλειψης, στα οποία κατά την οικοδόμηση παραλείφθηκε ένα αμινοξύ, καθώς και βραχυσμένες αλληλουχίες λόγω πρόωρης διακοπής της αλυσίδας. Παράλληλα εμφανίζονται προϊόντα ατελούς αποπροστασίας, στα οποία παραμένουν ομάδες προστασίας στο μόριο, καθώς και προϊόντα ρακεμίωσης με μεταβληθείσα στερεοχημεία. Αυτές οι συγγενικές ενώσεις διαφέρουν συχνά μόνο ελάχιστα από το πεπτίδιο-στόχο και εκλούονται αντίστοιχα κοντά στην κύρια κορυφή.
Μετά την αποθήκευση μπορεί να προστεθούν περαιτέρω προϊόντα αποδόμησης. Σύμφωνα με την ανασκόπηση των Lai & Topp, 1999, η απαμίδωση, η διάσπαση του πεπτιδικού δεσμού, η οξείδωση, η αντίδραση Maillard, η βήτα-απόσπαση και η συσσωμάτωση συγκαταλέγονται στις σημαντικότερες χημικές αντιδράσεις στη στερεά κατάσταση. Στο χρωματογράφημα τέτοιες διεργασίες εκδηλώνονται ως νέες ή αυξανόμενες δευτερεύουσες κορυφές. Ένα CoA που δημιουργείται απευθείας μετά τη σύνθεση τεκμηριώνει επομένως την αρχική κατάσταση, ενώ το πραγματικό προφίλ στο ερευνητικό εργαστήριο εξαρτάται επιπλέον από τον χειρισμό και την αποθήκευση.
Η καθαρότητα που τεκμηριώνεται στο CoA ισχύει για τη χρονική στιγμή της μέτρησης, συνήθως απευθείας μετά τη σύνθεση και τον καθαρισμό. Τα ερευνητικά πεπτίδια παραδίδονται γι' αυτό σχεδόν πάντα ως λυοφιλοποιημένο προϊόν, δηλαδή ως λυοφιλιωμένη σκόνη, επειδή η αφαίρεση του νερού επιβραδύνει σημαντικά τις υδρολυτικές και οξειδωτικές οδούς αποδόμησης. Σύμφωνα με τους Lai & Topp, 1999, η χημική σταθερότητα στη στερεά κατάσταση καθορίζεται ουσιαστικά από τη θερμοκρασία, την υπολειπόμενη υγρασία και τη φυσική κατάσταση: ακόμη και μικρή υπολειπόμενη υγρασία μπορεί να επιταχύνει τη συσσωμάτωση.
Αυτό σημαίνει πρακτικά: η ωραιότερη δήλωση 99% ωφελεί ελάχιστα αν το υλικό αποθηκευτεί στη συνέχεια ακατάλληλα. Μια δροσερή, ξηρή και προστατευμένη από το φως φύλαξη του σφραγισμένου λυοφιλοποιημένου προϊόντος διατηρεί για το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα το προφίλ που τεκμηριώνεται στο CoA. Όταν ένα πεπτίδιο ανασυσταθεί, δηλαδή τεθεί σε διάλυμα, οι αντιδράσεις αποδόμησης που εξαρτώνται από το νερό αρχίζουν να εξελίσσονται ταχύτερα, και το αρχικό χρωματογράφημα χάνει την ισχύ του. Όποιος θέλει να ερμηνεύσει σωστά τα δεδομένα καθαρότητας πρέπει επομένως να διαχωρίζει τη χρονική στιγμή της μέτρησης από αυτήν της χρήσης: το CoA περιγράφει την κατάσταση κατά την παράδοση, όχι τη μόνιμη κατάσταση καθ' όλη τη διάρκεια χρήσης.
Ένας συστηματικός έλεγχος διαρκεί μόλις λίγα λεπτά και κάνει απτές τις αφηρημένες τιμές. Διατρέξτε το έγγραφο με την ακόλουθη σειρά:
Αν λείπει ένα από αυτά τα σημεία, το CoA είναι ελλιπές. Ιδιαίτερα κρίσιμη είναι η απουσία των πρωτότυπων γραφικών: χωρίς χρωματογράφημα και φάσμα, ο αριθμός καθαρότητας παραμένει μια απλή δήλωση. Αντιθέτως, ένα πλήρες έγγραφο συνδεδεμένο με την παρτίδα και με όλα τα ακατέργαστα δεδομένα είναι το ισχυρότερο σήμα ποιότητας που μπορεί να φέρει μαζί του ένα ερευνητικό πεπτίδιο. Σας επιτρέπει να κατανοήσετε μόνοι σας τις δηλώσεις, αντί να βασίζεστε σε έναν μεμονωμένο αριθμό.
Η καθαρότητα HPLC είναι μια σχετική δήλωση επιφάνειας και δηλώνει ποιο τμήμα των ενεργών στο UV συστατικών αντιστοιχεί στο πεπτίδιο-στόχο. Η περιεκτικότητα σε πεπτίδιο, αντιθέτως, δηλώνει πόσο καθαρό πεπτίδιο περιέχεται ανά χιλιοστόγραμμο συνολικής σκόνης, και λαμβάνει υπόψη και τα ανενεργά στο UV συστατικά, όπως άλατα και υπολειπόμενο νερό. Και οι δύο τιμές αλληλοσυμπληρώνονται και θα πρέπει να εξετάζονται ξεχωριστά.
Όχι αυτόματα, καθώς ο αριθμός εξαρτάται από τη μέθοδο. Ένα τεκμηριωμένο χρωματογράφημα στο 98% μπορεί να είναι πιο διαφωτιστικό από μια γυμνή δήλωση 99% χωρίς πρωτογενή δεδομένα. Καθοριστικό είναι η καθαρότητα να τεκμηριώνεται με ένα κατανοητό χρωματογράφημα που αφορά την παρτίδα και η μέθοδος μέτρησης να αναφέρεται με σαφήνεια.
Η HPLC διαχωρίζει μόνο σύμφωνα με φυσικοχημικές ιδιότητες και δείχνει τη συμπεριφορά διαχωρισμού, όχι τη μοριακή σύσταση. Δύο διαφορετικά μόρια θα μπορούσαν θεωρητικά να εκλουστούν με παρόμοιο τρόπο. Μόνο η φασματομετρία μάζας μετρά το μοριακό βάρος και επιβεβαιώνει, μέσω αντιπαραβολής με τη θεωρητική τιμή, ότι υπάρχει όντως το πεπτίδιο-στόχος.
Ένα CoA τεκμηριώνει την κατάσταση κατά τη χρονική στιγμή του ελέγχου, συνήθως απευθείας μετά τη σύνθεση. Παραμένει έγκυρο ως απόδειξη προέλευσης, αλλά δεν περιγράφει την κατάσταση μετά από μακρά ή ακατάλληλη αποθήκευση. Προσέξτε για μια αναφερόμενη ημερομηνία ελέγχου και λάβετε υπόψη ότι η πραγματική καθαρότητα εξαρτάται από τις συνθήκες αποθήκευσης.
Μόνο για ερευνητικούς σκοπούς. Δεν προορίζεται για ανθρώπινη κατανάλωση. Επιστημονική επιμέλεια: Dr. Sieglinde Klaus
