A HPLC-tisztaság és a CoA helyes olvasása peptideknél
Dr. Sieglinde Klaus
Tudományos szerkesztés · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Tudományos szerkesztés · Bergdorf Bioscience
A HPLC-tisztaság azt adja meg, hogy egy kromatogram területének hány százaléka tartozik a célpeptidhez, míg a Certificate of Analysis (CoA, analízisbizonylat) ezt az értéket a tömegspektrometriával megerősített azonossággal, a gyártási tétellel és a vizsgálati módszerekkel együtt dokumentálja. A >=99% érték azt jelenti, hogy az UV-detektor jelében csak nagyon csekély terület esik a mellékkomponensekre. Ez az útmutató elmagyarázza, hogyan jön létre mindkét adat, és hogyan tudja Ön ellenőrizni őket.
A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) fizikai-kémiai tulajdonságok szerint választja szét az oldott peptidkeveréket, és így láthatóvá teszi, hány komponensből áll egy minta. A peptidanalitikában a fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) dominál C18-, C8- vagy C4-oszlopokon, mert a molekulákat hidrofobicitásuk szerint választja szét, és eközben nagy szétválasztóképességet nyújt. Mant és munkatársai, 2007 módszertani áttekintése szerint a HPLC több mint 25 éve a szintetikus peptidek izolálásának és tisztaságmeghatározásának legsokoldalúbb eljárásának számít.
Konkrétan egy mozgófázis, többnyire víz és acetonitril gradiense 0,05-0,1% trifluorecetsavval (TFA), halad át az oszlopon. Minden komponens egy jellemző időpontban, az úgynevezett retenciós időben hagyja el az oszlopot, és az UV-detektoron (jellemzően 214 vagy 220 nm-nél, ahol a peptidkötés abszorbeál) csúcsot hoz létre. A HPLC tehát nem egy anyag azonosságát méri, hanem annak szétválási viselkedését és relatív mennyiségi arányát. Az azonosság megállapításához egy második módszerre van szükség: a tömegspektrometriára.
A HPLC-tisztaság százalékos adata a fő csúcs területének arányát írja le az összes detektált csúcs összterületéhez viszonyítva. 99%-nál tehát az integrált UV-jelterület 99%-a esik a célpeptidre, és csupán 1% az összes mellékkomponensre együttvéve. Fontos, hogy ez egy relatív területadat, nem pedig tömegadat: a maradék oldószerek, sók vagy víz, amelyek 214 nm-nél alig abszorbeálnak, nem számítanak bele ebbe az értékbe. Ezért a megbízható gyártók a HPLC-tisztaságot további mutatókkal, például a nettó peptidtartalommal egészítik ki.
A mellékkomponensek többnyire a szilárdfázisú szintézisből származnak. Boysen és Hearn, 2006 szerint a lépésenkénti szintézis során mindenekelőtt deléciós szekvenciák (egy hiányzó aminosav), megrövidült szekvenciák, valamint a hiányos védőcsoport-eltávolításból vagy a racemizációból származó termékek keletkeznek. Pontosan ezeket a kémiailag nagyon hasonló szennyeződéseket nehéz elválasztani, és ezek határozzák meg, milyen magas az elérhető tisztaság. A 95%-ról 99%-ra való ugrás tehát azt jelenti, hogy ezeket a rokon vegyületeket nagyrészt eltávolították. Magáról az anyagosztályról bővebb háttér-információt a Mik azok a peptidek? útmutatóban talál.
A CoA egy konkrét gyártási tétel vizsgálati jegyzőkönyve, amely az összes elvégzett elemzés eredményeit egyetlen dokumentumon foglalja össze. Jellemzően megnevezi a termék nevét, az összegképletet és az elméleti molekulatömeget, a tételszámot, a gyártás vagy vizsgálat dátumát, valamint az alkalmazott módszereket. A magját két blokk alkotja: az azonosság tömegspektrometriával történő megerősítése és a tisztaság HPLC-vel történő meghatározása. Gyakran ezenfelül szerepel a megjelenésre vonatkozó megállapítás (fehér liofilizátum) és a víztartalom.
Döntő jelentőségű, hogy egy megbízható CoA az eredeti adatokat mutatja, és nem csupán egy számot állít. Ehhez tartozik az ábrázolt HPLC-kromatogram a retenciós idővel és az integrációs területekkel, valamint a tömegspektrum a mért m/z-értékkel. Így egy szakértő személy ellenőrizni tudja az állításokat ahelyett, hogy csupán elhinné őket. A módszeradatoknak pontosnak kell lenniük, például az oszlop típusa, a gradiens, a detektálási hullámhossz és az alkalmazott ionizációs eljárás. A BergdorfBionál a tételspecifikus CoA szolgál bizonyítékul a kezdőlapon megfogalmazott >=99%-os HPLC- és CoA-vállalásra. Az olyan termékeket, mint a BPC-157 vagy a Retatrutid, mindig ilyen, a tételhez tartozó dokumentummal szállítjuk.
Míg a HPLC csak a szétválási viselkedést mutatja, a tömegspektrometria arra a kérdésre ad választ, hogy a megfelelő molekula van-e jelen. A peptidanalitikában az elektrospray-ionizáció (ESI) dominál, egy kíméletes ionizációs eljárás, amely a molekulákat fragmentáció nélkül viszi át a gázfázisba. Banerjee és Mazumdar, 2012 szerint az ESI többszörösen töltött ionokat hoz létre, aminek köszönhetően a mérhető m/z-tartomány jelentősen kibővül, és a nagy peptidek is pontosan meghatározhatók.
A CoA-n a mért molekulatömeget szembeállítják az összegképletből számított elméleti értékkel. Ha mindkettő néhány tömegegységnyi pontossággal megegyezik, a peptid azonossága megerősített. Például 18 tömegegységnyi eltérés vízveszteségre utalhat, egy nagyobb különbség pedig hibás vagy szennyezett szekvenciára. A két módszer összekapcsolása, vagyis az LC-MS, különösen meggyőző: Toll és munkatársai, 2005 kimutatták, hogy egy tripszines emésztés több mint 50 peptidje 15-20 perc alatt elválasztható és egyúttal ESI-MS-sel azonosítható. Az azonosság és a tisztaság így egyetlen futás során rögzíthető.
A kromatogram minden CoA grafikus magmondanivalója: az x-tengelyen az idő áll percben, az y-tengelyen a detektorválasz, többnyire milliabszorpciós egységben (mAU). A célpeptid magas, keskeny fő csúcsként jelenik meg a jellemző retenciós idejénél, módszertől függően például 8-12 percnél. Egy tisztán kidolgozott minta egyetlen, éles és szimmetrikus csúcsot mutat, az esetleges mellékcsúcsoktól való egyértelmű alapvonal-elválasztással.
Az olvasáskor három dologra figyeljen. Először a csúcsalakra: egy erősen ferde csúcs (tailing) vagy egy kiszélesedett alap koeluáló szennyeződésekre vagy oszlopproblémákra utalhat. Másodszor a kis mellékcsúcsokra: ezek a szintézis melléktermékeit jelentik; területük összege adja ki a 100%-os jelhez hiányzó százalékos arányt. Harmadszor az alapvonalra: annak laposnak és nyugodtnak kell lennie, elsodródás nélkül. Az integráció, vagyis az egyes csúcsok alatti terület számszerű meghatározása, végül megadja a százalékos számokat. A TFA-tartalmú mozgófázis ezenközben javítja a csúcsélességet, mivel a TFA mint ionpárképző reagens elfedi a peptid bázikus oldalláncait, és így homogénebb elúciós viselkedést hoz létre (Mant és munkatársai, 2007).
Egyetlen százalékos adat összefüggés nélkül keveset ér, mert módszerfüggő. Ugyanaz a minta két különböző oszlopon vagy két detektálási hullámhosszon kissé eltérő értékeket adhat, mivel a szétválás és a mellékkomponensek UV-abszorpciója változik. Egy csupán egyetlen hullámhosszon mért 99%-os tisztaság csak akkor győz meg, ha a módszer teljes egészében dokumentált, és a hozzá tartozó kromatogram mellékelve van. Egy puszta szám spektrum nélkül nem ellenőrizhető.
Ehhez hozzájárul, hogy a HPLC-tisztaság nem ragadja meg az UV-inaktív alkotórészeket. A szintézis- és tisztítási folyamatból származó sók, például az acetát- vagy trifluoracetát-ellenionok, valamint a maradékvíz tömeget adnak hozzá anélkül, hogy a kromatogramban megjelennének. Ezért a nettó peptidtartalom, amelyet gyakran aminosav-analízissel vagy nitrogénmeghatározással állapítanak meg, értelmes kiegészítés: megmondja, mennyi tiszta peptid van ténylegesen porgrammonként. Az azonosság (MS), a relatív tisztaság (HPLC) és az abszolút tartalom három különböző kérdés, amelyekre egy jó CoA külön-külön ad választ.
Minden szintézissorozat egy önálló kémiai folyamat saját ingadozásokkal, ezért egy CoA-t mindig egy konkrét tételhez kell rendelni. Egy generikus adatlap, amelynek egy termék összes valaha gyártott egységére érvényesnek kellene lennie, nem vizsgálati bizonyíték, hanem reklámállítás. Csak a dokumentumon szereplő tételszám kapcsolja össze a mért értékeket az Ön előtt lévő fiolában található fizikai anyaggal. A retenciós idő, a tömegspektrum és a tisztaság pontosan erre a gyártási egységre érvényes.
Ez azért is lényeges, mert a szennyeződési profil tételenként eltérhet. Az egyik tétel talán 99,2%-ot ér el, egy másik 98,6%-ot, kissé eltérő mellékcsúcs-mintázattal. Csak egy tételhez kötött CoA tükrözi ezt a valóságot. A gyakorlatban érdemes összevetnie a címkén szereplő tételszámot a CoA-n lévővel, ellenőriznie a vizsgálati dátumot, és megbizonyosodnia arról, hogy a kromatogram valóban mellékelve van. Ha hiányzik a tételhivatkozás vagy az eredeti adatlap, a tisztasági adat nem ellenőrizhető, függetlenül attól, milyen magas a szám.
A fő csúcs melletti kis csúcsok nem véletlenszerűek, hanem meghatározott kémiai okuk van. A szilárdfázisú szintézisből mindenekelőtt deléciós peptidek származnak, amelyeknél a felépítés során kihagytak egy aminosavat, valamint megrövidült szekvenciák a lánc idő előtti megszakadása miatt. Emellett a hiányos védőcsoport-eltávolítás termékei is előfordulnak, amelyeknél védőcsoportok maradnak a molekulán, valamint megváltozott sztereokémiájú racemizációs termékek. Ezek a rokon vegyületek gyakran csak minimálisan különböznek a célpeptidtől, és ennek megfelelően közel eluálnak a fő csúcshoz.
A tárolás után további bomlástermékek jelenhetnek meg. Lai és Topp, 1999 áttekintése szerint a dezamidálás, a peptidkötés hasadása, az oxidáció, a Maillard-reakció, a béta-elimináció és az aggregáció tartozik a szilárd halmazállapotban lejátszódó legfontosabb kémiai reakciók közé. A kromatogramban az ilyen folyamatok új vagy növekvő mellékcsúcsokként nyilvánulnak meg. Egy közvetlenül a szintézis után készített CoA tehát a kiindulási állapotot dokumentálja; a tényleges profil a kutatólaborban ezenfelül a kezeléstől és a tárolástól is függ.
A CoA-n dokumentált tisztaság a mérés időpontjára érvényes, ami többnyire közvetlenül a szintézis és a tisztítás után van. A kutatási peptideket ezért szinte mindig liofilizátumként, vagyis fagyasztva szárított porként szállítják, mert a víz elvonása erősen lelassítja a hidrolitikus és oxidatív bomlási útvonalakat. Lai és Topp, 1999 szerint a kémiai stabilitást szilárd halmazállapotban döntő mértékben a hőmérséklet, a maradék nedvesség és a halmazállapot határozza meg; már csekély maradék nedvesség is felgyorsíthatja az aggregációt.
A gyakorlatban ez azt jelenti: a legszebb 99%-os adat is keveset ér, ha az anyagot ezt követően szakszerűtlenül tárolják. A lezárt liofilizátum hűvös, száraz és fénytől védett tárolása őrzi meg a leghosszabb ideig a CoA-n dokumentált profilt. Ha egy peptidet rekonstituálnak, vagyis oldatba visznek, a víztől függő bomlási reakciók gyorsabban kezdenek lejátszódni, és az eredeti kromatogram elveszíti érvényességét. Aki helyesen akarja értelmezni a tisztasági adatokat, annak ezért különbséget kell tennie a mérés és a felhasználás időpontja között: a CoA a kiszállítási állapotot írja le, nem pedig a tartós állapotot a teljes felhasználási időtartam alatt.
Egy szisztematikus ellenőrzés csak néhány percig tart, és kézzelfoghatóvá teszi az elvont értékeket. Menjen végig a dokumentumon ebben a sorrendben:
Ha ezen pontok valamelyike hiányzik, a CoA hiányos. Különösen kritikus az eredeti grafikák hiánya: kromatogram és spektrum nélkül a tisztasági szám puszta állítás marad. Egy teljes, tételhez kötött dokumentum az összes nyersadattal viszont a legerősebb minőségi jelzés, amelyet egy kutatási peptid magával hozhat. Lehetővé teszi Önnek, hogy maga ellenőrizze az állításokat, ahelyett, hogy egy elszigetelt számra hagyatkozna.
A HPLC-tisztaság egy relatív területadat, és azt mondja meg, hogy az UV-aktív alkotórészek mekkora hányada esik a célpeptidre. A peptidtartalom ezzel szemben azt adja meg, mennyi tiszta peptid található az összpor milligrammjában, és figyelembe veszi az UV-inaktív alkotórészeket is, mint a sókat és a maradékvizet. A két érték kiegészíti egymást, és külön-külön kell őket szemlélni.
Nem automatikusan, mivel a szám módszerfüggő. Egy 98%-os dokumentált kromatogram informatívabb lehet, mint egy puszta 99%-os adat eredeti adatok nélkül. A döntő az, hogy a tisztaságot egy ellenőrizhető, tételspecifikus kromatogram támassza alá, és a mérési módszer egyértelműen meg legyen adva.
A HPLC csak fizikai-kémiai tulajdonságok szerint választ szét, és a szétválási viselkedést mutatja, nem a molekuláris összetételt. Két különböző molekula elméletileg hasonlóan eluálhatna. Csak a tömegspektrometria méri a molekulatömeget, és az elméleti értékkel való összevetés révén erősíti meg, hogy valóban a célpeptid van jelen.
Egy CoA a vizsgálat időpontjában fennálló állapotot dokumentálja, többnyire közvetlenül a szintézis után. Származási bizonyítékként érvényes marad, de nem írja le a hosszú vagy szakszerűtlen tárolás utáni állapotot. Figyeljen a megnevezett vizsgálati dátumra, és vegye figyelembe, hogy a valós tisztaság a tárolási körülményektől függ.
Kizárólag kutatási célokra. Emberi fogyasztásra nem alkalmas. Tudományos szerkesztőség: Dr. Sieglinde Klaus
