Peptidek tárolása és eltarthatósága: a teljes útmutató
Dr. Sieglinde Klaus
Tudományos szerkesztés · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Tudományos szerkesztés · Bergdorf Bioscience
A liofilizált kutatási peptidek akkor maradnak a legstabilabbak, ha szárazon, sötétben és mélyhűtve tárolják őket: -20 Celsius-fokon évekig, a leghosszabb eltarthatósághoz pedig opcionálisan -80 Celsius-fokon. A feloldott oldatok 2 és 8 Celsius-fok között a hűtőszekrénybe valók, és néhány héten belül fel kell használni őket. Az ismételt fagyasztás és felolvasztás a molekula épségének legnagyobb ellensége.
A peptidek rövid aminosavláncok, amelyek működése egy pontos kémiai szerkezethez kötődik. Már csekély bomlási folyamatok is mérhetően csökkenthetik egy kutatási készítmény tisztaságát. A meghatározó bomlási útvonalak a peptidkötés hidrolízise, az érzékeny oldalláncok, mint a metionin, cisztein és triptofán oxidációja, valamint az aszparagin és glutamin deamidálása. Ezek a reakciók annál gyorsabban zajlanak, minél több víz, hő, fény és oxigén van jelen.
A fehérjegyógyszerek stabilitásáról szóló átfogó áttekintésben Manning et al., 2010 mind a kémiai instabilitást (deamidálás, oxidáció, hidrolízis, racemizáció), mind a fizikai instabilitást (aggregáció, kicsapódás, denaturáció, felületi adszorpció) a központi mechanizmusokként írja le. A gyakorlat szempontjából döntő: ez a két kategória összefügg, egy kémiailag megváltozott molekula hajlamosabb az aggregációra.
A kutatási anyag laboratóriumi tárolása szempontjából ez egy egyértelmű elvet jelent: távolítsuk el a vizet, vagy fagyasszuk be a molekulák mozgékonyságát. A liofilizált (fagyasztva szárított) peptidek egy száraz, üvegszerű mátrixban vannak, amelyben a bomlási reakciók gyakorlatilag leállnak. Amint víz kerül hozzájuk, megindul az óra. Aki tehát maximalizálni szeretné az eltarthatóságot, az minimalizálja a nedvességet, alacsonyan tartja a hőmérsékletet, és a teljes tárolási időtartam alatt csökkenti a levegővel és fénnyel való érintkezést.
Egy kutatási peptid legstabilabb formája a liofilizált por. A fagyasztva szárítás során a víz vákuum alatt távozik, így egy amorf, üvegszerű mátrix jön létre, amely fizikailag rögzíti a molekulákat, és drasztikusan lelassítja a hidrolitikus és oxidatív folyamatokat. Wang, 200000423-3) nagy hatású áttekintésében leírja, hogy a fehérjéket gyakran szilárd formába kell vinni az elfogadható eltarthatóság elérése érdekében, és hogy a tárolási hőmérsékletnek jóval az üvegesedési átmeneti hőmérséklet alatt kell lennie.
A laboratóriumi gyakorlatra érvényes: a liofilizált port -20 Celsius-fokon tárolják, ami a legtöbb szekvencia esetében több éves stabilitást tesz lehetővé. Különösen érzékeny peptidek, például a cisztein- vagy metioninoldalláncot tartalmazók esetében, vagy több évre tervezett tárolás esetén a -80 Celsius-fok az előnyösebb, mivel itt a bomlás csaknem elhanyagolható marad.
Fontos a légmentesen zárt edény. A maradék nedvesség a kritikus tényező: már csekély vízmennyiségek is csökkentik a kémiai stabilitást, ezért az eredeti üvegcsét zárva kell tartani, és érdemes lehet egy nedvszívót elhelyezni a tárolótartályban. Kerülje továbbá a jegesedésmentes (No-Frost) fagyasztókat, mivel ezek automatikus leolvasztási ciklusai időszakosan megemelik a hőmérsékletet, és így nem szándékolt részleges felolvasztásokat idéznek elő. Címkézzen fel minden edényt az anyaggal, gyártási tétellel és a beérkezés dátumával, hogy az eltarthatóság nyomon követhető maradjon. Egy állandó, ingadozásmentes alacsony hőmérséklet értékesebb, mint egy alkalmanként még mélyebb érték.
Amint egy peptidet bakteriosztatikus vízzel feloldottak, elhagyja a védő száraz formát, és ismét egy vizes közegben van, amelyben a hidrolízis és az oxidáció aktívan zajlik. A feloldott oldat ezért 2 és 8 Celsius-fok között a hűtőszekrénybe való, és nem szabad szobahőmérsékleten hagyni. Ebben a hőmérsékleti tartományban sok peptid néhány hétig használható marad, a szekvenciától és érzékenységtől függően.
A bakteriosztatikus jelző döntő: a bakteriosztatikus víz 0,9 százalék benzil-alkoholt tartalmaz, amely gátolja a mikrobiális növekedést, és így egyáltalán értelmessé teszi az oldat több hetes hűtőszekrényes tárolását. A tartósítószer nélküli tiszta víz nem nyújtja ezt a védelmet. Az oldás pontos menetét a peptidek feloldásáról szóló útmutatónk ismerteti.
A pufferkémia mérhetően befolyásolja a stabilitást. Az oxidáció és a deamidálás pH- és hőmérsékletfüggő: Manning et al., 2010 megmutatja, hogy a deamidálás báziskatalizált, és az aszparagin-glicin szekvenciákban különösen gyorsan zajlik, míg a metioninoxidáció a semleges tartományban éri el a maximumát. A laboratóriumi gyakorlat számára ez azt jelenti: tartsa hidegen, védje a fénytől, lehetőleg minél kevesebb levegővel való érintkezést engedjen, és ne tárolja az oldatot a szükségesnél tovább. Aki nagyobb mennyiségeket old fel, annak érdemes elgondolkodnia az aliquotokra osztáson, amelyet a következő szakaszban tárgyalunk.
Minden fagyasztási-felolvasztási ciklus fizikai szinten stresszeli az oldott peptideket. A fagyás során jégkristályok képződnek, amelyek növekedése mechanikai erőket hoz létre, és szoros érintkezésbe kényszeríti a molekulákat; ezzel egyidejűleg az oldott anyagok feldúsulnak a megmaradó folyékony tartományokban, ami lokálisan szélsőséges körülményeket teremt. Az eredmény aggregáció és az ép hatóanyag lassú elvesztése.
Jain et al., 2021 a Scientific Reports-ban célzottan vizsgálta egy monoklonális antitest fagyasztási-felolvasztási stresszét, és megmutatta, hogy az aggregáció optimalizált fagyasztási és felolvasztási körülményekkel jelentősen csökkenthető. A tanulmány keretet ad ahhoz, hogyan minimalizálhatók a károk a laboratóriumi léptéktől a gyártásig. Az átvihető felismerés: nem maga a fagyasztás a probléma, hanem a körülmények és a ciklusok gyakorisága.
A gyakorlatban ez egy egyszerű szabályt jelent: korlátozza a fagyasztási-felolvasztási ciklusok számát. A rövid, egyszerű peptidek gyakran több ciklust is jól tűrnek kis veszteséggel, míg a hosszabb és összetettebben hajtogatott szekvenciák már két-három ciklus után is mérhető kárt szenvedhetnek. A gyors fagyasztás -80 Celsius-fokon és a gyors felolvasztás szobahőmérsékleten alacsonyan tartja a terhelést egy cikluson belül. Aki ugyanazt a törzsoldatot újra és újra lefagyasztja és felolvasztja, az feleslegesen gyorsítja a bomlást. A megoldás az aliquotokra osztás.
Az aliquotokra osztás egy feloldott törzsoldat több kis adagra (aliquotra) történő felosztását jelenti, amelyeket külön fagyasztanak le. Ahelyett, hogy minden kivételkor egyetlen edényt olvasztanánk fel és fagyasztanánk vissza, csak az éppen szükséges aliquotot olvasztjuk fel. Minden üvegcse így ideális esetben pontosan egy fagyasztási-felolvasztási cikluson megy keresztül, sok helyett. Ez az egyszeri felolvasztás elve a laboratóriumi gyakorlatban a fagyasztás-felolvasztás okozta bomlás elleni leghatékonyabb védelemnek számít.
Ennek oka a bomlás egyenetlenségében rejlik: minden felolvasztási folyamat alkalom a részleges degradációra, aggregációra vagy az edény falára való adszorpcióra, és ezek a változások nem oszlanak el egyenletesen az összes molekula között. Azzal, hogy a törzsoldatot korán adagokra osztjuk, a túlnyomó részt a meghatározott kiindulási állapotban fagyasztjuk le. Jain et al., 2021 ajánlása, hogy a fagyasztási-felolvasztási körülményeket kontrollálni kell, így közvetlenül egy egyszerű munkaprotokollra fordítható le.
A gyakorlatban az oldatot steril, felcímkézett mikrocsövekre osztják, amelyek mérete a kísérletenkénti szokásos felhasználáshoz igazodik. Használjon fehérjeszegény edényeket az adszorpciós veszteségek csökkentése érdekében, és ne töltse színültig, mivel a fagyó folyadék kitágul. Címkézzen fel minden aliquotot az anyaggal, koncentrációval és dátummal. Egy felolvasztott aliquot fel nem használt maradékát kidobják, nem fagyasztják vissza. Így a fő készlet hónapokon át állandó minőségben marad, miközben csak kis mennyiségek vannak kitéve a felolvasztási stressznek.
A víz és a hő mellett a fény és az oxigén két gyakran alábecsült bomlási tényező. Az oxidáció főként a kéntartalmú oldalláncokat, a metionint és a ciszteint, valamint az aromás triptofánt érinti. A metionin metionin-szulfoxiddá, majd tovább szulfonná oxidálódik, amely átalakulás gyakorlatilag visszafordíthatatlan. A levegő oxigénje és a fény felgyorsítja ezt a folyamatot, ezért mindkettővel az érintkezést minimalizálni kell.
Badgett et al., 2017 HILIC-tömegspektrometria segítségével megmutatta, hogy az oxidált metionint és deamidált aszparagint tartalmazó peptidek tisztán elválaszthatók és mennyiségileg meghatározhatók a változatlan megfelelőiktől. Ez bizonyítja, hogy ezek a módosulások valóban előforduló, mérhető változások, nem pedig elméleti kockázatok. A tárolás szempontjából ebből az következik, hogy a fény- és levegőexpozíció csökkentésére tett minden intézkedés megőrzi az ép hányadot.
Konkrétan ez azt jelenti: tárolja a peptideket fényt át nem eresztő vagy borostyánszínű tartályokban, illetve az eredeti dobozban, az ablakfénytől és UV-forrásoktól távol. Tartsa az edényt a kivételek között zárva, hogy korlátozza a levegővel való érintkezést. Különösen oxidációra hajlamos szekvenciák esetén egy inert gázzal, például nitrogénnel vagy argonnal való rétegezés kiszoríthatja a maradék oxigént az edény fejterében. Az alacsony hőmérséklettel és szárazsággal kombinálva a fénytől és oxigéntől való védelem hézagmentes védelmi koncepciót ad, amely jelentősen meghosszabbítja a kutatási anyag hasznosítható eltarthatóságát.
A liofilizált termékben lévő segédanyagok (excipiensek) lényegesen hozzájárulnak a tárolási stabilitáshoz. A diszacharidok, mint a trehalóz és a szacharóz, a leghatékonyabb lioprotektoroknak számítanak: hidrogénkötéseket képeznek a peptid poláris csoportjaihoz, és így pótolják az eltávolított víz stabilizáló szerepét az üvegszerű mátrixban. Karunnanithy et al., 2024 arról számol be, hogy a trehalóz ebben gyakran jobban teljesít, mint a szacharóz, mivel lassabb molekuláris forgása kevésbé zavarja a fehérjeszerkezetet.
Ugyanilyen döntő a kész liofilizátum maradék nedvessége. Az alacsony maradék nedvesség a terméket az üvegesedési átmeneti hőmérséklet alatt, és így a stabil üvegszerű állapotban tartja; ha a nedvesség emelkedik, a kémiai stabilitás csökken, függetlenül attól, hogy az anyag üvegszerű vagy már gumiszerű formában van-e jelen. Ezek az összefüggések Wang, 200000423-3) alapvető munkájára vezethetők vissza, aki részletesen tárgyalja a krio- és lioprotekciót.
A tárolási gyakorlat számára ebből több fogantyú adódik. Tárolja a peptidet az eredeti üvegcsében ép szeptummal, hogy megakadályozza a nedvességfelvételt. Helyezzen egy nedvszívót (szilikagélt) a körülvevő tárolótartályba, különösen, ha az edényeket kiveszik a fagyasztóból, mivel felmelegedéskor páralecsapódás képződik. Hagyja ezért a zárt üvegcséket a kinyitás előtt szobahőmérsékletre felmelegedni, hogy ne kondenzálódjon nedvesség a belsejükbe. Ezek a kis óvintézkedések megvédik a fáradságosan felépített szárazstabilitást, és megakadályozzák, hogy a behatoló nedvesség lerövidítse az eltarthatóságot.
Egy lebomlott vagy szennyezett peptid részben szabad szemmel, részben csak analitikailag ismerhető fel. A liofilizált pornál érvényes: egy ép készítmény egyenletes fehér vagy krémszínű pogácsaként vagy finom porként jelenik meg. A feltűnő elszíneződések, egy összeesett vagy elfolyósodott pogácsa, vagy látható nedvesség az üvegcsében figyelmeztető jelek a nedvesség behatolására vagy a szakszerűtlen tárolásra.
A feloldás után egy helyesen feloldott mintának tisztának és részecskementesnek kell lennie. A zavarosság, csíkozottság, pelyhek vagy egy látható csapadék aggregációra vagy mikrobiális szennyeződésre utal, mindkettő arra utal, hogy az anyag nem alkalmas megbízható kutatási eredményekhez. Ahogy fentebb leírtuk, az aggregáció a fagyasztási-felolvasztási stressz és a fizikai instabilitás közvetlen következménye, amelyet Manning et al., 2010 központi mechanizmusként nevez meg.
A tisztaság megbízható megítélése azonban műszeres úton történik. Badgett et al., 2017 módszere bemutatja, hogy az oxidált és deamidált változatok kromatográfiásan elválaszthatók és mennyiségileg meghatározhatók az ép formától; a gyakorlatban ehhez HPLC-t és tömegspektrometriát alkalmaznak. A látható változások tehát csak a durva első szintet jelentik. A kvantitatív kutatáshoz ajánlott a beérkezés dátumát dokumentálni, a látható rendellenességeket jegyzőkönyvezni, és kétség esetén analitikai jellemzéshez folyamodni, mielőtt kétes anyag kerülne egy kísérletbe.
A reális eltarthatóság erősen függ a peptid állapotától. Liofilizált porként -20 Celsius-fokon sok szekvencia több éven át stabil marad; -80 Celsius-fokon a bomlás olyan csekély, hogy nagyon hosszú tárolás lehetséges. Szobahőmérsékleten ezzel szemben a hasznosítható eltarthatóság drasztikusan lerövidül, mivel a hidrolízis és az oxidáció lényegesen gyorsabban zajlik.
A feloldott oldatok lényegesen rövidebb életűek. A hűtőszekrényben 2 és 8 Celsius-fok között szekvenciától és érzékenységtől függően néhány hét számít szokásos keretnek; az oxidációra vagy deamidálásra hajlamos peptidek ennek a tartománynak az alsó végén helyezkednek el. Pontosan ezért olyan értékes a korai aliquotokra osztás és a -20 vagy -80 Celsius-fokon való fagyasztás: visszaviszi a rövid életű oldatot egy hosszabb életű állapotba anélkül, hogy ismételt felolvasztási stressznek tenné ki.
A pontos számok szekvenciánként, formulázásonként és a jelen lévő segédanyagok szerint változnak, ezért Manning et al., 2010 hangsúlyozza, hogy a szekvencia, az érzékeny oldalláncok és a formulázás együttesen határozzák meg a stabilitást. Az eltarthatósági adatokat ezért szekvenciafüggő irányértékként kezelje, ne pedig fix garanciaként. Egy jó hüvelykujjszabály a labor számára: szárazon és mélyhűtve gondolkodjon években, feloldva és hűtve gondolkodjon hetekben. Aki az oldásnál bizonytalan, az megtalálja az alapokat a Mik a peptidek? című útmutatónkban, valamint a feloldásról szóló részletes leírásban.
Alapvetően igen, de minden további fagyasztási-felolvasztási ciklus növeli az aggregáció és a hatóanyagveszteség kockázatát. Jain et al., 2021 megmutatja, hogy a fagyasztás-felolvasztás okozta károk kontrollált körülményekkel csökkenthetők. Lényegesen jobb azonban az oldatot már a kezdetektől aliquotokra osztani, és aliquotonként csak egyetlen felolvasztási folyamatot engedélyezni.
Sok liofilizált peptid esetében a -20 Celsius-fok elegendő, feltéve, hogy a készülék nem rendelkezik automatikus leolvasztási ciklusú No-Frost rendszerrel, mivel ezek időszakosan megemelik a hőmérsékletet. Több éves tároláshoz vagy különösen érzékeny szekvenciákhoz egy -80 Celsius-fokos mélyhűtő az előnyösebb, mert a bomlás ott csaknem leáll.
A hideg üveg a szobalevegővel való érintkezéskor páralecsapódást vonz. Ha egy jéghideg üvegcsét azonnal kinyitunk, nedvesség kerül a porra, és felgyorsítja a hidrolízist és a bomlást. Ha a zárt edényt először hagyjuk temperálódni, a tartalom száraz marad, és a fáradságosan elért szárazstabilitás megmarad.
Nem, a benne lévő benzil-alkohol antimikrobiálisan hat, nem kémiailag stabilizálóan. Megakadályozza a mikrobiális növekedést, és így értelmessé teszi egy oldat több hetes hűtőszekrényes tárolását, de nem véd a hidrolízis vagy az oxidáció ellen. Ezeket továbbra is a hűtés, a fényvédelem és a korlátozott levegővel való érintkezés kontrollálja.
Szekvenciától és érzékenységtől függően néhány hét számít szokásos keretnek 2 és 8 Celsius-fok között. Az oxidációra vagy deamidálásra hajlamos peptidek az alsó végén helyezkednek el. Mivel a pontos eltarthatóság szekvenciafüggő, dokumentálja a feloldás dátumát, és dobja ki a látható zavarosságot vagy csapadékot mutató oldatokat.
Kizárólag kutatási célokra. Emberi fogyasztásra nem alkalmas. For research purposes only. Not for human consumption.
Tudományos szerkesztőség: Dr. Sieglinde Klaus
Így rekonstituálja liofilizált kutatási peptidjeit bakteriosztatikus vízzel: lépések, mennyiségszámítás, tárolás. Dolgozzon tisztán a laborban.
Was sind Peptide? Herstellung (SPPS), Reinheit (HPLC), Lyophilisierung. Mit 7 PubMed-Referenzen. Wissenschaftlich fundierter Leitfaden.