Czystość HPLC i CoA peptydów: jak je poprawnie czytać
Dr. Sieglinde Klaus
Redakcja naukowa · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Redakcja naukowa · Bergdorf Bioscience
Czystość HPLC wskazuje, jaki procentowy udział powierzchni chromatogramu przypada na peptyd docelowy, podczas gdy Certyfikat Analizy (CoA) dokumentuje tę wartość wraz z tożsamością potwierdzoną metodą spektrometrii mas, numerem serii oraz zastosowanymi metodami badawczymi. Wartość >=99% oznacza, że w sygnale detektora UV jedynie bardzo niewielka powierzchnia przypada na składniki uboczne. Niniejszy przewodnik wyjaśnia, jak powstają obie te informacje i jak można je samodzielnie zweryfikować.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) rozdziela rozpuszczoną mieszaninę peptydową według właściwości fizykochemicznych, dzięki czemu uwidacznia, z ilu składników zbudowana jest próbka. W analityce peptydów dominuje chromatografia w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) na kolumnach C18, C8 lub C4, ponieważ rozdziela ona cząsteczki według ich hydrofobowości, zapewniając przy tym wysoką zdolność rozdzielczą. Według przeglądu metodycznego autorstwa Mant et al., 2007 HPLC od ponad 25 lat uchodzi za najbardziej wszechstronną technikę izolacji i oznaczania czystości peptydów syntetycznych.
W praktyce faza ruchoma, najczęściej gradient wody i acetonitrylu z dodatkiem 0,05 do 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA), przepływa przez kolumnę. Każdy składnik opuszcza kolumnę w charakterystycznym dla siebie momencie, zwanym czasem retencji, i generuje na detektorze UV (typowo 214 lub 220 nm, gdzie absorbuje wiązanie peptydowe) pik. HPLC nie mierzy zatem tożsamości substancji, lecz jej zachowanie podczas rozdziału oraz względny udział ilościowy. Do stwierdzenia tożsamości potrzebna jest druga metoda, czyli spektrometria mas.
Wartość procentowa czystości HPLC opisuje udział powierzchni piku głównego w sumie powierzchni wszystkich wykrytych pików. Przy 99% oznacza to, że 99% scałkowanej powierzchni sygnału UV przypada na peptyd docelowy, a jedynie 1% na wszystkie składniki uboczne łącznie. Istotne jest, że jest to względna wartość powierzchniowa, a nie wagowa: pozostałości rozpuszczalników, sole czy woda, które przy 214 nm niemal nie absorbują, nie są uwzględniane w tej wartości. Dlatego rzetelni producenci uzupełniają czystość HPLC o dodatkowe parametry, takie jak zawartość peptydu netto.
Składniki uboczne pochodzą najczęściej z syntezy na fazie stałej. Według Boysen & Hearn, 2006 podczas syntezy etapowej powstają przede wszystkim sekwencje delecyjne (z brakującym aminokwasem), sekwencje skrócone oraz produkty niepełnego odbezpieczenia lub racemizacji. Właśnie te chemicznie bardzo podobne zanieczyszczenia są trudne do oddzielenia i decydują o tym, jak wysoka czystość jest w ogóle osiągalna. Skok z 95% na 99% oznacza zatem, że te pokrewne związki zostały w znacznym stopniu usunięte. Więcej informacji na temat samej klasy substancji znajdziesz w przewodniku Czym są peptydy?.
CoA to protokół badawczy konkretnej serii, który łączy wyniki wszystkich przeprowadzonych analiz w jednym dokumencie. Zazwyczaj podaje on nazwę produktu, wzór sumaryczny oraz teoretyczną masę cząsteczkową, numer serii, datę produkcji lub badania, a także zastosowane metody. Trzon stanowią dwa bloki: potwierdzenie tożsamości metodą spektrometrii mas oraz oznaczenie czystości metodą HPLC. Często dodatkowo podawany jest opis wyglądu (biały liofilizat) oraz zawartość wody.
Kluczowe jest to, że wiarygodny CoA pokazuje dane źródłowe, a nie tylko podaje jakąś liczbę. Należą do nich przedstawiony chromatogram HPLC z czasem retencji i powierzchniami całkowania oraz widmo masowe ze zmierzoną wartością m/z. Dzięki temu osoba kompetentna może prześledzić te informacje, zamiast po prostu w nie wierzyć. Dane dotyczące metody powinny być precyzyjne, na przykład typ kolumny, gradient, długość fali detekcji oraz zastosowana technika jonizacji. W BergdorfBio CoA przypisany do serii stanowi dowód na podaną na stronie głównej obietnicę >=99% czystości HPLC i CoA. Produkty takie jak BPC-157 czy Retatrutyd są dostarczane wraz z takim dokumentem przypisanym do konkretnej serii.
Podczas gdy HPLC pokazuje jedynie zachowanie podczas rozdziału, spektrometria mas odpowiada na pytanie, czy mamy do czynienia z właściwą cząsteczką. W analityce peptydów dominuje jonizacja przez elektrorozpylanie (ESI), łagodna technika jonizacji, która przeprowadza cząsteczki do fazy gazowej bez ich fragmentacji. Według Banerjee & Mazumdar, 2012 ESI wytwarza jony wielokrotnie naładowane, dzięki czemu mierzalny zakres m/z zostaje znacznie poszerzony i nawet duże peptydy można precyzyjnie oznaczyć.
W CoA zmierzona masa cząsteczkowa zostaje zestawiona z wartością teoretyczną obliczoną na podstawie wzoru sumarycznego. Jeśli obie wartości zgadzają się co do kilku jednostek masy, tożsamość peptydu jest potwierdzona. Odchylenie wynoszące na przykład 18 jednostek masy mogłoby wskazywać na utratę cząsteczki wody, a większa różnica na błędną lub zanieczyszczoną sekwencję. Sprzężenie obu metod, czyli LC-MS, jest szczególnie wartościowe: Toll et al., 2005 wykazali, że ponad 50 peptydów z trawienia trypsynowego można rozdzielić w ciągu 15 do 20 minut i jednocześnie zidentyfikować metodą ESI-MS. Tożsamość i czystość zostają w ten sposób zarejestrowane w jednym przebiegu analitycznym.
Chromatogram to graficzna esencja każdego CoA: na osi x znajduje się czas w minutach, na osi y odpowiedź detektora, najczęściej w miliabsorpcyjnych jednostkach (mAU). Peptyd docelowy pojawia się jako wysoki, wąski pik główny w swoim charakterystycznym czasie retencji, na przykład w przedziale 8 do 12 minut, w zależności od metody. Starannie przygotowana próbka wykazuje pojedynczy, ostry i symetryczny pik z wyraźnym oddzieleniem od linii bazowej względem ewentualnych pików ubocznych.
Przy odczycie zwróć uwagę na trzy rzeczy. Po pierwsze na kształt piku: silnie zniekształcony pik (ogonowanie) lub poszerzona podstawa mogą wskazywać na współeluujące zanieczyszczenia lub problemy z kolumną. Po drugie na małe piki uboczne: odpowiadają one produktom ubocznym syntezy, a suma ich powierzchni daje brakujący udział procentowy do poziomu 100%. Po trzecie na linię bazową: powinna ona przebiegać płasko i spokojnie, bez dryfu. Całkowanie, czyli matematyczne wyznaczenie powierzchni pod każdym pikiem, dostarcza ostatecznie wartości procentowych. Faza ruchoma zawierająca TFA poprawia przy tym ostrość pików, ponieważ TFA jako odczynnik tworzący pary jonowe maskuje zasadowe łańcuchy boczne peptydu, wytwarzając w ten sposób bardziej jednorodne zachowanie elucyjne (Mant et al., 2007).
Pojedyncza wartość procentowa bez kontekstu jest mało warta, ponieważ zależy od zastosowanej metody. Ta sama próbka na dwóch różnych kolumnach lub przy dwóch długościach fali detekcji może dawać nieco odmienne wartości, ponieważ rozdział oraz absorpcja UV składników ubocznych są zmienne. Czystość 99% zmierzona przy tylko jednej długości fali przekonuje dopiero wtedy, gdy metoda jest w pełni udokumentowana, a odpowiadający jej chromatogram dołączony. Samej liczby bez widma nie da się zweryfikować.
Dochodzi do tego fakt, że czystość HPLC nie obejmuje składników nieaktywnych w UV. Sole pochodzące z procesu syntezy i oczyszczania, na przykład przeciwjony octanowe lub trifluorooctanowe, oraz pozostałości wody wnoszą masę, nie pojawiając się przy tym w chromatogramie. Dlatego zawartość peptydu netto, często oznaczana metodą analizy aminokwasowej lub oznaczenia azotu, jest sensownym uzupełnieniem: mówi ona, ile czystego peptydu faktycznie przypada na każdy miligram proszku. Tożsamość (MS), czystość względna (HPLC) oraz zawartość bezwzględna to trzy różne pytania, na które dobry CoA odpowiada osobno.
Każda seria syntezy to odrębny proces chemiczny z własnymi wahaniami, dlatego CoA musi być zawsze przypisany do konkretnej serii. Ogólna karta danych, która miałaby obowiązywać dla wszystkich kiedykolwiek wyprodukowanych jednostek danego produktu, nie jest dowodem badania, lecz hasłem reklamowym. Dopiero numer serii na dokumencie wiąże zmierzone wartości z fizycznym materiałem znajdującym się w fiolce przed Tobą. Czas retencji, widmo masowe oraz czystość obowiązują dokładnie dla tej jednostki produkcyjnej.
Jest to istotne również dlatego, że profil zanieczyszczeń może różnić się pomiędzy seriami. Jedna seria osiąga być może 99,2%, a inna 98,6% z nieco innym układem pików ubocznych. Tylko CoA przypisany do serii odzwierciedla tę rzeczywistość. W praktyce powinieneś porównać numer serii na etykiecie z numerem na CoA, sprawdzić datę badania i upewnić się, że chromatogram faktycznie został dołączony. Jeśli brakuje powiązania z serią lub oryginalnej karty danych, podana czystość jest nieweryfikowalna, niezależnie od tego, jak wysoka jest ta liczba.
Małe piki obok piku głównego nie są dziełem przypadku, lecz mają określone przyczyny chemiczne. Z syntezy na fazie stałej pochodzą przede wszystkim peptydy delecyjne, w których podczas budowy łańcucha pominięto jeden aminokwas, oraz sekwencje skrócone na skutek przedwczesnego przerwania łańcucha. Obok nich występują produkty niepełnego odbezpieczenia, w których grupy ochronne pozostają na cząsteczce, a także produkty racemizacji o zmienionej stereochemii. Te pokrewne związki różnią się często jedynie minimalnie od peptydu docelowego i eluują odpowiednio blisko piku głównego.
Po przechowywaniu mogą dojść dalsze produkty rozkładu. Według przeglądu autorstwa Lai & Topp, 1999 do najważniejszych reakcji chemicznych w stanie stałym należą deamidacja, rozszczepienie wiązania peptydowego, utlenianie, reakcja Maillarda, eliminacja beta oraz agregacja. W chromatogramie procesy te objawiają się jako nowe lub rosnące piki uboczne. CoA sporządzony bezpośrednio po syntezie dokumentuje zatem stan wyjściowy; rzeczywisty profil w laboratorium badawczym zależy dodatkowo od sposobu obchodzenia się z materiałem i jego przechowywania.
Czystość udokumentowana w CoA obowiązuje dla momentu pomiaru, najczęściej bezpośrednio po syntezie i oczyszczeniu. Peptydy badawcze są dlatego niemal zawsze dostarczane jako liofilizat, czyli proszek liofilizowany, ponieważ usunięcie wody znacznie spowalnia hydrolityczne i utleniające ścieżki rozkładu. Według Lai & Topp, 1999 stabilność chemiczna w stanie stałym jest w decydującym stopniu określana przez temperaturę, wilgotność resztkową oraz stan skupienia; już niewielka wilgotność resztkowa może przyspieszyć agregację.
W praktyce oznacza to: najpiękniejsza wartość 99% niewiele daje, jeśli materiał jest następnie nieprawidłowo przechowywany. Chłodne, suche i chronione przed światłem przechowywanie zamkniętego liofilizatu najdłużej zachowuje profil udokumentowany w CoA. Gdy peptyd zostaje zrekonstytuowany, czyli wprowadzony do roztworu, reakcje rozkładu zależne od wody zaczynają przebiegać szybciej, a pierwotny chromatogram traci swoją ważność. Kto chce poprawnie interpretować dane o czystości, musi zatem rozróżniać moment pomiaru i moment użycia: CoA opisuje stan w chwili dostawy, a nie stan trwały przez cały okres użytkowania.
Systematyczna weryfikacja trwa zaledwie kilka minut i sprawia, że abstrakcyjne wartości stają się namacalne. Przejdź przez dokument w następującej kolejności:
Jeśli brakuje któregoś z tych punktów, CoA jest niekompletny. Szczególnie krytyczny jest brak oryginalnych wykresów: bez chromatogramu i widma liczba opisująca czystość pozostaje jedynie deklaracją. Kompletny dokument przypisany do serii, zawierający wszystkie dane surowe, jest natomiast najsilniejszym sygnałem jakości, jaki może nieść ze sobą peptyd badawczy. Pozwala on samodzielnie prześledzić podane informacje, zamiast polegać na jednej wyrwanej z kontekstu liczbie.
Czystość HPLC to względna wartość powierzchniowa i mówi, jaki udział składników aktywnych w UV przypada na peptyd docelowy. Zawartość peptydu natomiast wskazuje, ile czystego peptydu przypada na każdy miligram całego proszku, i uwzględnia także składniki nieaktywne w UV, takie jak sole i pozostałości wody. Obie wartości uzupełniają się i należy rozpatrywać je osobno.
Niekoniecznie, ponieważ ta liczba zależy od zastosowanej metody. Udokumentowany chromatogram przy 98% może być bardziej wymowny niż wyrwana z kontekstu wartość 99% bez danych źródłowych. Decydujące jest to, że czystość jest poparta weryfikowalnym chromatogramem przypisanym do serii oraz że metoda pomiarowa została jasno podana.
HPLC rozdziela jedynie według właściwości fizykochemicznych i pokazuje zachowanie podczas rozdziału, a nie skład cząsteczkowy. Dwie różne cząsteczki mogłyby teoretycznie eluować w podobny sposób. Dopiero spektrometria mas mierzy masę cząsteczkową i potwierdza poprzez porównanie z wartością teoretyczną, że faktycznie mamy do czynienia z peptydem docelowym.
CoA dokumentuje stan z momentu badania, najczęściej bezpośrednio po syntezie. Pozostaje on ważny jako dowód pochodzenia, lecz nie opisuje stanu po długim lub nieprawidłowym przechowywaniu. Zwróć uwagę na podaną datę badania i uwzględnij, że rzeczywista czystość zależy od warunków przechowywania.
Wyłącznie do celów badawczych. Nieprzeznaczone do spożycia przez ludzi. Redakcja naukowa: Dr. Sieglinde Klaus
