Thymosin Alpha-1: tymiczny peptyd immunologiczny w przeglądzie badawczym
Dr. Sieglinde Klaus
Redakcja naukowa · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Redakcja naukowa · Bergdorf Bioscience
Thymosin Alpha-1 (Tα1, INN: Thymalfasin) to peptyd zbudowany z 28 aminokwasów, acetylowany na końcu N, pochodzący z grasicy, badany w nauce jako peptyd immunomodulujący i biologiczny modyfikator odpowiedzi. Pierwotnie został wyizolowany z grasicy cielęcej, a jego sekwencja została określona (Goldstein et al., 1977). Syntetyczna forma lecznicza nosi nazwę handlową Zadaxin.
Thymosin Alpha-1 to tymiczny polipeptyd, który w 1977 roku został wyizolowany z grasicy cielęcej przez Goldsteina i współpracowników oraz w pełni zsekwencjonowany (Goldstein et al., 1977). Substancja składa się z 28 reszt aminokwasowych i należy do klasy peptydów immunomodulujących, które w immunologii zalicza się do biologicznych modyfikatorów odpowiedzi. Charakterystyczna jest acetylacja na końcu N: końcowa seryna nosi grupę acetylową, która dodaje około 42 Da do masy cząsteczkowej i odróżnia dojrzałą formę od nieacetylowanego prekursora (Liu et al., 2013).
Syntetyczna, farmaceutycznie ustandaryzowana forma nosi międzynarodową nazwę niezastrzeżoną Thymalfasin i jest oferowana pod nazwą handlową Zadaxin. W opracowaniach historycznych Tα1 opisywany jest jako jeden z najdłużej badanych peptydów grasicy, którego badania obejmują kilka dziesięcioleci (Camerini & Garaci, 2015). Tα1 to termostabilna, silnie kwasowa cząsteczka, której właściwości fizykochemiczne udokumentowano już w pierwszym opisie (Goldstein et al., 1977).
Ważne dla klasyfikacji: Thymosin Alpha-1 nie jest peptydem regenerującym tkanki ani peptydem angiogennym, lecz w badaniach traktowany jest przede wszystkim jako modulator połączenia między odpornością wrodzoną a nabytą (Dominari et al., 2020).
Sekwencja aminokwasowa Thymosin Alpha-1 obejmuje 28 reszt i w kodzie jednoliterowym brzmi Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN, czyli acetylowana seryna na końcu N, a następnie pełny łańcuch aż do końcowej asparaginy (Goldstein et al., 1977). Uderzający jest wysoki udział kwasowych aminokwasów, takich jak asparaginian i glutaminian, który nadaje cząsteczce silnie kwasowy charakter.
Masa cząsteczkowa dojrzałej, N-acetylowanej formy wynosi około 3108 do 3109 Da; charakterystyka metodą spektrometrii mas podaje 3108,79 Da (Liu et al., 2013). Wariant nieacetylowany ma mniejszą masę, około 3065 Da; grupa acetylowa dodaje wspomniane około 42 Da. Ta acetylacja na końcu N jest według dostępnej literatury istotna strukturalnie dla pełnej aktywności biologicznej, a jednocześnie poprawia stabilność wobec rozkładu przez aminopeptydazy, ponieważ acetylacja wydłuża okres półtrwania w porównaniu z wolną formą aminową (Liu et al., 2013).
Dla praktyki laboratoryjnej oznacza to, że czystość i prawidłowa acetylacja są kluczowymi cechami jakości. Badacze powinni sprawdzać specyficzne dla partii certyfikaty analizy, które zazwyczaj wykazują stopnie czystości 98 procent lub wyższe oraz potwierdzenie acetylacji na końcu N. Termostabilność cząsteczki została już w pierwszym opisie podkreślona jako godna uwagi cecha (Goldstein et al., 1977).
Thymosin Alpha-1 opisywany jest w badaniach jako plejotropowy immunomodulator, który działa głównie na połączeniu między odpornością wrodzoną a nabytą (Romani et al., 2007). Centralny mechanizm działania przebiega przez receptory Toll-like: badania wskazują, że Tα1 sygnalizuje przez TLR2 na mieloidalnych komórkach dendrytycznych i przez TLR9 na plazmacytoidalnych komórkach dendrytycznych, a mianowicie przez szlak zależny od MyD88, który aktywuje IRF7 i prowadzi do szlaku efektorowego interferonu (IFN-α i IFN-γ) (Dominari et al., 2020).
Na poziomie komórkowym Tα1 według literatury wspiera dojrzewanie i różnicowanie komórek dendrytycznych oraz sprzyja polaryzacji Th1. Wiąże się to ze wzmocnioną funkcją limfocytów T (CD4+ i CD8+) oraz komórek NK i może w stanach immunokompromitacji ponownie podnosić obniżone liczby komórek (Dominari et al., 2020). Towarzysząco stymulowane są cytokiny, takie jak IFN-γ i IL-2.
Szczególnie interesującym aspektem jest podwójna regulacja: Tα1 indukuje w komórkach dendrytycznych indoloamino-2,3-dioksygenazę (IDO), a tym samym katabolizm tryptofanu, przez co powstaje środowisko regulacyjne równoważące stan zapalny i tolerancję (Romani et al., 2007). W badaniach Tα1 opisywany jest zatem jako endogenny regulator stanu zapalnego, odporności i tolerancji, który wzmacnia skuteczne odpowiedzi immunologiczne, a jednocześnie może tłumić nadmierną aktywację.
W dostępnej literaturze klinicznej i farmakologicznej standardowy schemat jest dobrze udokumentowany. Ustalony schemat przewiduje 1,6 mg podskórnie dwa razy w tygodniu, co w przybliżeniu odpowiada 900 µg na metr kwadratowy powierzchni ciała; stosowanie obejmowało w badaniach zazwyczaj okres od sześciu do dwunastu miesięcy (Dominari et al., 2020). Dla pediatrycznych lub o niskiej masie ciała uczestników badań poniżej 40 kg w literaturze opisywana jest dawka dostosowana do masy ciała wynosząca 40 µg na kilogram.
Formalne badania farmakokinetyczne również dawkowały na podstawie powierzchni ciała, w wysokości 900 µg/m² (Rost et al., 1999). Jeśli chodzi o tolerancję wyższych dawek, dostępne są dane, które w badaniach na ludziach nie wykazały żadnych niepożądanych reakcji aż do 16 mg dwa razy w tygodniu przez cztery tygodnie (Rost et al., 1999).
Do obliczeniowego planowania wielkości fiolek, objętości rekonstytucji i wynikających z nich ilości iniekcji peptyd można odwzorować w narzędziu Bergdorf: Oblicz Thymosin Alpha-1 w kalkulatorze peptydów. W ten sposób można na przykład prześledzić, jak z fiolki 1,6 mg przy objętości rekonstytucji 1 ml powstaje stężenie 1,6 mg/ml i która podziałka strzykawki insulinowej odpowiada dawce 1,6 mg. Wszystkie podane wartości pochodzą wyłącznie z literatury badawczej i fachowej informacji i nie należy ich rozumieć jako zalecenia stosowania u ludzi.
Po iniekcji podskórnej Thymosin Alpha-1 jest szybko i niemal całkowicie wchłaniany, co wskazuje na wysoką biodostępność (Rost et al., 1999). Maksymalne stężenie w osoczu (Tmax) osiągane jest około jedną do dwóch godzin po iniekcji. Stężenia szczytowe (Cmax) przy dawce 900 µg/m² mieściły się w zakresie około 30 do 80 µg/L (Rost et al., 1999).
Objętość dystrybucji podawana jest jako około 5 do 8 L, co odpowiada przestrzeni zewnątrzkomórkowej; jako mały, silnie kwasowy peptyd Tα1 wykazuje niskie wiązanie z białkami osocza. Eliminacja zachodzi poprzez rozkład proteolityczny za pośrednictwem tkankowych i krążących aminopeptydaz, przy czym odzysk nerkowy wynosi 31 do 60 procent dawki (Rost et al., 1999). Końcowy okres półtrwania w osoczu według fachowej informacji o Thymalfasin wynosi około 2 godzin; formalne badanie farmakokinetyczne trzech preparatów podskórnych podaje okres półtrwania eliminacji mniejszy niż 3 godziny (Rost et al., 1999).
Godne uwagi jest to, że poziomy w surowicy wracają do wartości wyjściowej w ciągu 24 godzin i przy powtarzanym podawaniu nie dochodzi do akumulacji (Rost et al., 1999). Właśnie ze względu na ten krótki okres półtrwania opracowano warianty fuzyjne o wydłużonym okresie półtrwania, aby zwiększyć skądinąd krótki czas przebywania natywnego peptydu (Camerini & Garaci, 2015).
Końcowy okres półtrwania w osoczu wynoszący około 2 godzin jest oparty na literaturze i potwierdzony zarówno w fachowej informacji o Thymalfasin, jak i niezależnie przez formalne badanie farmakokinetyczne, które określiło okres półtrwania eliminacji mniejszy niż 3 godziny przy Tmax wynoszącym jedną do dwóch godzin (Rost et al., 1999). Ten stosunkowo krótki czas przebywania w organizmie wyjaśnia dwie centralne obserwacje z literatury: brak akumulacji przy powtarzanym podawaniu i powrót poziomów w surowicy do wartości wyjściowej w ciągu 24 godzin.
Dla projektowania badań ma to konkretne konsekwencje. Stosowany w badaniach schemat dwa razy w tygodniu podawania podskórnego pozostaje w uderzającym kontraście z krótkim okresem półtrwania w osoczu. Sugeruje to, że działanie biologiczne Tα1 nie jest powiązane przede wszystkim z utrzymującymi się poziomami w osoczu, lecz z dalszymi efektami immunologicznymi, na przykład z wywołanym dojrzewaniem komórek dendrytycznych i polaryzacją Th1, które przypisuje się tej substancji (Romani et al., 2007).
Właśnie to odkrycie zmotywowało opracowanie konstruktów o wydłużonym okresie półtrwania, na przykład białek fuzyjnych Tα1-Fc, które zostały celowo skonstruowane, ponieważ okres półtrwania natywnego Tα1 jest krótki (Camerini & Garaci, 2015). Kto chce prześledzić profil eliminacji obliczeniowo, może wykorzystać okres półtrwania wynoszący około 2 godzin jako wartość wejściową do rozważań nad klirensem.
Komercyjny, liofilizowany Thymalfasin dostarczany jest jako proszek do rekonstytucji. Według informacji o produkcie wprowadzony do obrotu preparat przechowywany jest schłodzony w temperaturze 2 do 8 °C; rekonstytucja odbywa się z dołączoną jałową wodą względnie rozcieńczalnikiem bezpośrednio przed iniekcją podskórną. Te informacje dotyczące przechowywania pochodzą z fachowej informacji, a badacze powinni zawsze zwracać uwagę na specyficzne dla partii certyfikaty analizy.
Interesująca jest pozorna sprzeczność między wewnętrzną termostabilnością cząsteczki a wymogiem chłodzenia gotowego produktu leczniczego. Sam peptyd jest z natury termostabilny i silnie kwasowy, jak udokumentowano już w pierwszej charakterystyce (Goldstein et al., 1977). Jako liofilizowany produkt farmaceutyczny jest mimo to przechowywany w temperaturze 2 do 8 °C, co wynika ze stabilności całej formulacji, a nie wyłącznie z chemicznej odporności łańcucha aminokwasowego.
Dla praktyki laboratoryjnej można z tego wyprowadzić jasne zasady: liofilizowany proszek należy do lodówki w temperaturze 2 do 8 °C; po rekonstytucji roztwór powinien zostać użyty bez zwłoki. Acetylacja na końcu N przyczynia się do stabilności wobec aminopeptydaz i zwiększa odporność łańcucha na rozkład enzymatyczny (Liu et al., 2013). Konkretne temperatury przechowywania i terminy użycia należy odczytać z odpowiedniego certyfikatu analizy, ponieważ mogą one zmieniać się w zależności od partii.
W literaturze podsumowującej Thymosin Alpha-1 uchodzi za ogólnie bardzo dobrze tolerowany. Wśród ponad 2.000 leczonych pacjentów niepożądane doświadczenia opisywano jako rzadkie i łagodne (Dominari et al., 2020). Zgłaszane efekty obejmują reakcje miejscowe w miejscu iniekcji, takie jak zaczerwienienie lub dyskomfort, a także przemijający zanik mięśni, polialgię stawów w sensie wielu bólów stawów oraz obrzęk dłoni z wysypką skórną.
Wiarygodne wyjaśnienie korzystnej tolerancji leży w profilu farmakokinetycznym: brak akumulacji przy powtarzanym podawaniu i krótki okres półtrwania wynoszący około 2 godzin przyczyniają się według literatury do tolerancji, ponieważ peptyd nie gromadzi się w organizmie (Rost et al., 1999). Poziomy w surowicy wracają do wartości wyjściowej w ciągu 24 godzin, dzięki czemu nie powstaje ciągła ekspozycja ogólnoustrojowa.
Dane dotyczące tolerancji odnoszą się do badanych w literaturze dawkowań i schematów stosowania. Nawet w badaniach z eskalacją dawki na ludziach tolerowano aż do 16 mg dwa razy w tygodniu przez cztery tygodnie bez niepożądanych reakcji (Rost et al., 1999). Dane te służą wyłącznie naukowej klasyfikacji w kontekście badawczym i nie stanowią stwierdzenia na temat stosowania u ludzi poza kontrolowanymi badaniami.
Mimo wspólnego członu nazwy Thymosin Alpha-1 i Thymosin Beta-4 należą do różnych rodzin peptydów o odmiennych sekwencjach, wielkościach i funkcjach. Tα1 to immunomodulujący peptyd o długości 28 aminokwasów, N-acetylowany, który działa przez TLR2 i TLR9 oraz oś sygnałową komórek dendrytycznych i limfocytów T (Dominari et al., 2020). Thymosin Beta-4, którego TB-500 stanowi fragment, jest natomiast peptydem o długości 43 aminokwasów sekwestrującym G-aktynę, który steruje cytoszkieletową dynamiką aktyny, migracją komórek, angiogenezą i regeneracją tkanek. Struktura docelowa (receptory Toll-like i IDO wobec aktyny) oraz badany kierunek działania (odbudowa odporności wobec gojenia ran) różnią się zasadniczo.
Również BPC-157 wyraźnie się odróżnia: jest to syntetyczna cząsteczka o długości 15 aminokwasów, określana jako stabilny żołądkowy pentadekapeptyd, pochodząca z białka soku żołądkowego. Jej omawiane w badaniach właściwości dotyczą cytoprotekcji, angiogenezy oraz regeneracji ścięgien, więzadeł i jelit, często w związku ze szlakami VEGFR2 i eNOS. Tym samym BPC-157 to peptyd regeneracyjny i cytoprotekcyjny, a nie tymiczny peptyd immunomodulujący; pochodzenie, długość (15 wobec 28 aminokwasów) i mechanizm wyraźnie odbiegają od Tα1. Tα1 jest natomiast klasyfikowany jako endogenny regulator stanu zapalnego, odporności i tolerancji (Romani et al., 2007).
KPV to tripeptyd zbudowany z trzech aminokwasów (lizyna-prolina-walina) i odpowiada C-terminalnemu fragmentowi hormonu α-MSH. W badaniach KPV przypisuje się działanie przeciwzapalne, które jest pośredniczone głównie przez tłumienie prozapalnych sygnałów NF-κB i cytokin. KPV działa tym samym jako czynnik obniżający procesy zapalne.
Thymosin Alpha-1 obiera przeciwny pierwotny kierunek działania: jako peptyd o długości 28 aminokwasów wzmacnia i równoważy odporność nabytą, w szczególności poprzez primowanie Th1 za pośrednictwem aktywacji receptorów Toll-like i komórek dendrytycznych (Romani et al., 2007). Podczas gdy KPV tłumi stan zapalny, Tα1 przywraca reaktywność immunologiczną i ją koordynuje. Również wielkość i struktura docelowa różnią się znacznie: trzy aminokwasy i mechanizm pośredniczony przez NF-κB po stronie KPV wobec 28 aminokwasów i osi TLR2/TLR9 po stronie Tα1.
To zestawienie unaocznia, że proste przyporządkowanie obu peptydów do kategorii substancji immunoaktywnych byłoby mylące. KPV tłumi istniejącą nadmierną aktywację, podczas gdy Tα1 według dostępnej literatury równoważy osłabioną lub błędnie regulowaną odpowiedź immunologiczną i adresuje podwójną równowagę między odpornością efektorową a tolerancją poprzez indukcję IDO (Dominari et al., 2020).
Nie. Thymosin Alpha-1 i Thymosin Beta-4 (peptyd wyjściowy dla TB-500) dzielą jedynie człon nazwy, ale należą do różnych rodzin peptydów. Tα1 to immunomodulujący peptyd o długości 28 aminokwasów, który działa przez receptory Toll-like, podczas gdy Thymosin Beta-4 to peptyd o długości 43 aminokwasów wiążący aktynę, związany z regeneracją tkanek (Dominari et al., 2020).
Końcowy okres półtrwania w osoczu według fachowej informacji wynosi około 2 godzin, a formalne badanie farmakokinetyczne podaje mniej niż 3 godziny. Poziomy w surowicy wracają do wartości wyjściowej w ciągu 24 godzin, a przy powtarzanym podawaniu nie dochodzi do akumulacji (Rost et al., 1999).
Grupa acetylowa na końcu N dodaje około 42 Da do masy i jest według literatury istotna strukturalnie dla pełnej aktywności biologicznej. Jednocześnie poprawia stabilność wobec rozkładu przez aminopeptydazy i wydłuża tym samym okres półtrwania w porównaniu z wolną formą aminową (Liu et al., 2013).
Liofilizowany gotowy produkt leczniczy według informacji o produkcie przechowywany jest schłodzony w temperaturze 2 do 8 °C i rekonstytuowany bezpośrednio przed użyciem. Sam peptyd jest wewnętrznie termostabilny (Goldstein et al., 1977), chłodzenie dotyczy stabilności całej formulacji; wytyczne specyficzne dla partii należy odczytać z certyfikatu analizy.
Ustalony w literaturze schemat to 1,6 mg podskórnie dwa razy w tygodniu, co odpowiada około 900 µg na metr kwadratowy powierzchni ciała (Dominari et al., 2020). Dla uczestników badań o niskiej masie ciała poniżej 40 kg opisywana jest dawka dostosowana do masy ciała wynosząca 40 µg na kilogram. Dane te służą wyłącznie celom badawczym.
Wyłącznie do celów badawczych. Nie jest przeznaczony do spożycia przez ludzi. Redakcja naukowa: Dr. Sieglinde Klaus