Ler corretamente a pureza por HPLC e o CoA dos peptidos
Dr. Sieglinde Klaus
Equipa de redação científica · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Equipa de redação científica · Bergdorf Bioscience
A pureza por HPLC indica que percentagem da area de um cromatograma corresponde ao peptido alvo, ao passo que o Certificate of Analysis (CoA) documenta esse valor em conjunto com a identidade confirmada por espectrometria de massa, o lote e os metodos de ensaio. Um valor de >=99% significa que, no sinal do detetor UV, apenas uma area muito reduzida corresponde a componentes secundarios. Este guia explica como surgem ambas as indicacoes e como as pode verificar.
A cromatografia liquida de alta eficiencia (HPLC) separa uma mistura peptidica dissolvida de acordo com propriedades fisico-quimicas, tornando assim visivel de quantos componentes e composta uma amostra. Na analise de peptidos predomina a HPLC de fase reversa (RP-HPLC) em colunas de C18, C8 ou C4, porque separa as moleculas em funcao da sua hidrofobicidade, oferecendo uma elevada resolucao. Segundo a revisao metodologica de Mant et al., 2007, ha mais de 25 anos que a HPLC e considerada o procedimento mais versatil para o isolamento e a determinacao da pureza de peptidos sinteticos.
Concretamente, uma fase movel, geralmente um gradiente de agua e acetonitrilo com 0,05 a 0,1% de acido trifluoroacetico (TFA), percorre a coluna. Cada componente abandona a coluna num momento caracteristico, o tempo de retencao, gerando um pico no detetor UV (tipicamente a 214 ou 220 nm, onde a ligacao peptidica absorve). A HPLC nao mede, portanto, a identidade de uma substancia, mas sim o seu comportamento de separacao e a sua proporcao relativa em quantidade. Para uma afirmacao sobre a identidade e necessario um segundo metodo: a espectrometria de massa.
A indicacao percentual da pureza por HPLC descreve a proporcao da area do pico principal relativamente a area total de todos os picos detetados. A 99%, 99% da area integrada do sinal UV corresponde, assim, ao peptido alvo e apenas 1% ao conjunto de todas as componentes secundarias. E importante reter que se trata de uma indicacao relativa de area e nao de uma indicacao em massa: solventes residuais, sais ou agua, que praticamente nao absorvem a 214 nm, nao entram neste valor. Por essa razao, os fabricantes serios complementam a pureza por HPLC com outros parametros, como o teor liquido de peptido.
As componentes secundarias provem, na sua maioria, da sintese em fase solida. Segundo Boysen & Hearn, 2006, na sintese passo a passo formam-se sobretudo sequencias de delecao (com um aminoacido em falta), sequencias truncadas, bem como produtos de desprotecao incompleta ou de racemizacao. Sao precisamente estas impurezas quimicamente muito semelhantes que sao dificeis de separar e que determinam o nivel de pureza alcancavel. Um salto de 95% para 99% significa, por isso, que estes compostos aparentados foram amplamente removidos. Pode encontrar mais contexto sobre a propria classe de substancias no guia O que sao peptidos?.
Um CoA e o protocolo de ensaio de um lote concreto e reune os resultados de todas as analises realizadas num unico documento. Tipicamente, indica o nome do produto, a formula molecular e o peso molecular teorico, o numero de lote, a data de fabrico ou de ensaio, bem como os metodos aplicados. O nucleo e formado por dois blocos: a confirmacao da identidade por espectrometria de massa e a determinacao da pureza por HPLC. Com frequencia indicam-se ainda o resultado do exame de aspeto (liofilizado branco) e o teor de agua.
O decisivo e que um CoA solido apresente os dados originais e nao se limite a afirmar um numero. Disso fazem parte o cromatograma de HPLC representado, com tempo de retencao e areas de integracao, bem como o espetro de massa com o valor de m/z medido. Assim, uma pessoa qualificada pode acompanhar e confirmar as afirmacoes, em vez de simplesmente acreditar nelas. As indicacoes do metodo devem ser precisas, por exemplo o tipo de coluna, o gradiente, o comprimento de onda de detecao e o processo de ionizacao utilizado. Na BergdorfBio, o CoA referente ao lote serve de comprovativo da garantia de HPLC e CoA >=99% mencionada na pagina inicial. Produtos como o BPC-157 ou o Retatrutido sao entregues, cada um, com um documento deste tipo relativo ao lote.
Enquanto a HPLC apenas mostra o comportamento de separacao, a espectrometria de massa responde a questao de saber se esta presente a molecula correta. Na analise de peptidos predomina a ionizacao por electrospray (ESI), um processo de ionizacao suave que transfere as moleculas para a fase gasosa sem fragmentacao. Segundo Banerjee & Mazumdar, 2012, a ESI gera ioes com varias cargas, o que alarga significativamente a gama de m/z mensuravel e permite determinar com precisao tambem peptidos de grandes dimensoes.
No CoA, o peso molecular medido e confrontado com o valor teorico calculado a partir da formula molecular. Se ambos coincidirem dentro de poucas unidades de massa, a identidade do peptido esta confirmada. Um desvio de, por exemplo, 18 unidades de massa poderia indicar uma perda de agua, enquanto uma diferenca maior apontaria para uma sequencia errada ou contaminada. O acoplamento de ambos os metodos, ou seja, a LC-MS, e particularmente esclarecedor: Toll et al., 2005 demonstraram que mais de 50 peptidos de uma digestao triptica podiam ser separados em 15 a 20 minutos e, simultaneamente, identificados por ESI-MS. A identidade e a pureza sao assim captadas numa unica corrida.
O cromatograma e a afirmacao grafica central de qualquer CoA: no eixo dos x esta o tempo em minutos e no eixo dos y a resposta do detetor, geralmente em miliunidades de absorvancia (mAU). O peptido alvo surge como um pico principal alto e estreito no seu tempo de retencao caracteristico, por exemplo entre 8 e 12 minutos, consoante o metodo. Uma amostra trabalhada de forma cuidada apresenta um pico unico, agudo e simetrico, com clara separacao da linha de base relativamente a eventuais picos secundarios.
Ao ler, preste atencao a tres aspetos. Primeiro, a forma do pico: um pico muito assimetrico (tailing) ou uma base alargada podem indicar impurezas coeluentes ou problemas na coluna. Segundo, os pequenos picos secundarios: estes representam subprodutos de sintese; a soma das suas areas corresponde a percentagem em falta ate a marca dos 100%. Terceiro, a linha de base: deve apresentar-se plana e estavel, sem deriva. A integracao, ou seja, a determinacao matematica da area sob cada pico, fornece por fim os valores percentuais. Uma fase movel contendo TFA melhora a nitidez dos picos, ja que o TFA, enquanto reagente de par ionico, mascara as cadeias laterais basicas do peptido, gerando assim um comportamento de eluicao mais homogeneo (Mant et al., 2007).
Uma unica indicacao percentual sem contexto vale pouco, porque depende do metodo. A mesma amostra pode fornecer valores ligeiramente diferentes em duas colunas distintas ou a dois comprimentos de onda de detecao, ja que a separacao e a absorvancia UV das componentes secundarias variam. Uma pureza de 99%, medida a um unico comprimento de onda, so convence quando o metodo esta totalmente documentado e o cromatograma correspondente vem anexado. Um numero nu, sem espetro, nao pode ser verificado.
A isto acresce que a pureza por HPLC nao capta os componentes inativos no UV. Os sais provenientes do processo de sintese e de purificacao, como os contraioes acetato ou trifluoroacetato, bem como a agua residual, contribuem com massa sem aparecerem no cromatograma. Por isso, o teor liquido de peptido, muitas vezes determinado por analise de aminoacidos ou por determinacao de azoto, e um complemento util: indica quanto peptido puro esta efetivamente contido por miligrama de po. Identidade (MS), pureza relativa (HPLC) e teor absoluto sao tres questoes diferentes a que um bom CoA responde separadamente.
Cada serie de sintese e um processo quimico proprio, com as suas proprias variacoes, razao pela qual um CoA tem de estar sempre associado a um lote concreto. Uma ficha tecnica generica, que pretenda aplicar-se a todas as unidades de um produto alguma vez produzidas, nao e um comprovativo de ensaio, mas sim uma afirmacao publicitaria. So o numero de lote no documento liga os valores medidos ao material fisico que tem no frasco a sua frente. O tempo de retencao, o espetro de massa e a pureza valem exatamente para essa unidade de producao.
Isto e relevante tambem porque o perfil de impurezas pode diferir entre lotes. Um lote atinge talvez 99,2% e outro 98,6%, com um padrao de picos secundarios ligeiramente diferente. So um CoA associado ao lote reflete esta realidade. Na pratica, deve comparar o numero de lote da etiqueta com o do CoA, controlar a data de ensaio e certificar-se de que o cromatograma esta efetivamente incluido. Se faltar a associacao ao lote ou a ficha de dados original, a indicacao de pureza nao e verificavel, independentemente de quao elevado seja o numero.
Os pequenos picos junto ao pico principal nao sao casuais, mas tem causas quimicas definidas. Da sintese em fase solida provem sobretudo peptidos de delecao, nos quais um aminoacido foi omitido durante a construcao, bem como sequencias truncadas por interrupcao prematura da cadeia. Para alem disso, surgem produtos de desprotecao incompleta, nos quais permanecem grupos protetores na molecula, assim como produtos de racemizacao com estereoquimica alterada. Estes compostos aparentados diferem muitas vezes apenas de forma minima do peptido alvo e eluem, por conseguinte, perto do pico principal.
Apos o armazenamento podem somar-se outros produtos de degradacao. Segundo a revisao de Lai & Topp, 1999, a desamidacao, a clivagem da ligacao peptidica, a oxidacao, a reacao de Maillard, a beta-eliminacao e a agregacao contam-se entre as reacoes quimicas mais importantes no estado solido. No cromatograma, tais processos manifestam-se sob a forma de picos secundarios novos ou crescentes. Um CoA elaborado logo apos a sintese documenta, por isso, o estado inicial; o perfil efetivo no laboratorio de investigacao depende adicionalmente do manuseamento e do armazenamento.
A pureza documentada no CoA vale para o momento da medicao, geralmente logo apos a sintese e a purificacao. Por isso, os peptidos de investigacao sao quase sempre entregues como liofilizado, ou seja, como po liofilizado, porque a remocao da agua abranda fortemente as vias de degradacao hidrolitica e oxidativa. Segundo Lai & Topp, 1999, a estabilidade quimica no estado solido e determinada de forma decisiva pela temperatura, pela humidade residual e pelo estado de agregacao; ja uma humidade residual reduzida pode acelerar a agregacao.
Na pratica, isto significa: a mais bela indicacao de 99% pouco serve se o material for depois armazenado de forma inadequada. Uma conservacao do liofilizado fechado em local fresco, seco e ao abrigo da luz preserva por mais tempo o perfil documentado no CoA. Quando um peptido e reconstituido, ou seja, colocado em solucao, as reacoes de degradacao dependentes da agua comecam a decorrer mais depressa, e o cromatograma original perde a sua validade. Quem quiser interpretar corretamente os dados de pureza tem, por isso, de distinguir o momento da medicao do momento da utilizacao: o CoA descreve o estado de entrega, nao o estado permanente ao longo de todo o periodo de utilizacao.
Uma verificacao sistematica demora apenas alguns minutos e torna tangiveis os valores abstratos. Percorra o documento por esta ordem:
Se faltar um destes pontos, o CoA esta incompleto. Particularmente critica e a ausencia das figuras originais: sem cromatograma e sem espetro, o numero da pureza permanece uma mera afirmacao. Em contrapartida, um documento completo, associado ao lote e com todos os dados brutos, e o sinal de qualidade mais forte que um peptido de investigacao pode trazer consigo. Permite-lhe acompanhar e confirmar as afirmacoes por si mesmo, em vez de se fiar num numero isolado.
A pureza por HPLC e uma indicacao relativa de area e diz que proporcao das componentes ativas no UV corresponde ao peptido alvo. O teor de peptido, por seu lado, indica quanto peptido puro esta contido por miligrama de po total, tendo tambem em conta componentes inativos no UV, como sais e agua residual. Ambos os valores complementam-se e devem ser considerados separadamente.
Nao automaticamente, ja que o numero depende do metodo. Um cromatograma documentado a 98% pode ser mais esclarecedor do que uma indicacao nua de 99% sem dados originais. O decisivo e que a pureza esteja comprovada por um cromatograma verificavel e associado ao lote, e que o metodo de medicao tenha sido claramente indicado.
A HPLC separa apenas de acordo com propriedades fisico-quimicas e mostra o comportamento de separacao, nao a composicao molecular. Duas moleculas diferentes poderiam, teoricamente, eluir de forma semelhante. So a espectrometria de massa mede o peso molecular e confirma, atraves da comparacao com o valor teorico, que esta efetivamente presente o peptido alvo.
Um CoA documenta o estado no momento do ensaio, geralmente logo apos a sintese. Mantem-se valido como comprovativo de origem, mas nao descreve o estado apos um armazenamento prolongado ou inadequado. Preste atencao a uma data de ensaio indicada e tenha em conta que a pureza real depende das condicoes de armazenamento.
Apenas para fins de investigacao. Nao se destina ao consumo humano. Redacao cientifica: Dr. Sieglinde Klaus
