Правилно четене на HPLC чистотата и CoA при пептиди
Dr. Sieglinde Klaus
Научна редакция · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Научна редакция · Bergdorf Bioscience
HPLC чистотата показва какъв процентен дял от площта в една хроматограма се пада на целевия пептид, докато Certificate of Analysis (CoA) документира тази стойност заедно с потвърдената чрез мас-спектрометрия идентичност, партидата и използваните методи на изпитване. Стойност от >=99% означава, че в сигнала на UV детектора само много малка част от площта се пада на странични компоненти. Това ръководство обяснява как възникват и двата показателя и как можете да ги проверите.
Високоефективната течна хроматография (HPLC) разделя разтворена пептидна смес според физикохимичните ѝ свойства и така прави видимо от колко компоненти се състои една проба. В пептидния анализ доминира обратнофазовата HPLC (RP-HPLC) върху C18, C8 или C4 колони, защото тя разделя молекулите според тяхната хидрофобност и при това осигурява висока разделителна способност. Според методологичния обзор на Mant et al., 2007 HPLC се счита от над 25 години за най-универсалния метод за изолиране и определяне на чистотата на синтетични пептиди.
Конкретно, през колоната преминава подвижна фаза, обикновено градиент от вода и ацетонитрил с 0,05 до 0,1% трифлуороцетна киселина (TFA). Всеки компонент напуска колоната в характерен момент, времето на задържане, и създава пик при UV детектора (типично при 214 или 220 nm, където поглъща пептидната връзка). Следователно HPLC не измерва идентичността на едно вещество, а неговото поведение при разделяне и относителния му количествен дял. За твърдение относно идентичността е необходим втори метод: мас-спектрометрията.
Процентната стойност на HPLC чистотата описва дела на площта на главния пик от общата площ на всички детектирани пикове. При 99% съответно 99% от интегрираната площ на UV сигнала се падат на целевия пептид и само 1% на всички странични компоненти, взети заедно. Важно е, че става дума за относителна стойност на площта, а не за стойност по тегло: остатъчни разтворители, соли или вода, които почти не поглъщат при 214 nm, не влизат в тази стойност. Затова сериозните производители допълват HPLC чистотата с други показатели като нетното съдържание на пептид.
Страничните компоненти произхождат най-често от твърдофазовия синтез. Според Boysen & Hearn, 2006 при стъпковия синтез възникват преди всичко делеционни последователности (липсваща аминокиселина), скъсени последователности, както и продукти от непълно деблокиране или рацемизация. Точно тези химически много сходни примеси са трудни за отделяне и определят колко висока е постижимата чистота. Скокът от 95% на 99% следователно означава, че тези сродни съединения са до голяма степен отстранени. Повече фон за самия клас вещества ще намерите в ръководството Какво представляват пептидите?.
CoA е протоколът от изпитването на конкретна партида и обединява резултатите от всички проведени анализи в един документ. Обикновено той посочва името на продукта, брутната формула и теоретичното молекулно тегло, номера на партидата, датата на производство или изпитване, както и приложените методи. Ядрото му образуват два блока: потвърждаването на идентичността чрез мас-спектрометрия и определянето на чистотата чрез HPLC. Често допълнително са посочени заключението относно външния вид (бял лиофилизат) и съдържанието на вода.
Решаващо е, че един надежден CoA показва оригиналните данни, а не просто твърди едно число. Към тях спадат изобразената HPLC хроматограма с време на задържане и площи на интегриране, както и мас-спектърът с измерената m/z стойност. Така компетентен човек може да проследи твърденията, вместо просто да им вярва. Данните за методите трябва да бъдат точни, например типът на колоната, градиентът, дължината на вълната на детекция и използваният метод на йонизация. При BergdorfBio свързаният с партидата CoA служи като доказателство за обещанието за >=99% HPLC и CoA, посочено на началната страница. Продукти като BPC-157 или Ретатрутид се доставят със съответен документ за партидата.
Докато HPLC показва само поведението при разделяне, мас-спектрометрията отговаря на въпроса дали е налична правилната молекула. В пептидния анализ доминира електроспрей йонизацията (ESI), щадящ метод на йонизация, който превежда молекулите в газова фаза без фрагментация. Според Banerjee & Mazumdar, 2012 ESI създава многократно заредени йони, при което измеримият m/z диапазон значително се разширява и така могат прецизно да бъдат определени и големи пептиди.
В CoA измереното молекулно тегло се съпоставя с теоретичната стойност, изчислена от брутната формула. Ако двете съвпадат до няколко масови единици, идентичността на пептида е потвърдена. Отклонение например от 18 масови единици би могло да указва за загуба на вода, по-голяма разлика - за грешна или замърсена последователност. Свързването на двата метода, тоест LC-MS, е особено информативно: Toll et al., 2005 показаха, че над 50 пептида от един триптичен разпад могат да бъдат разделени за 15 до 20 минути и едновременно идентифицирани чрез ESI-MS. Идентичността и чистотата се регистрират така в един и същ анализ.
Хроматограмата е графичното ядро на всеки CoA: на оста x стои времето в минути, на оста y - отговорът на детектора, обикновено в милиабсорбционни единици (mAU). Целевият пептид се появява като висок, тесен главен пик при характерното си време на задържане, например при 8 до 12 минути в зависимост от метода. Една чисто изработена проба показва единичен, остър и симетричен пик с ясно разделяне до базовата линия спрямо евентуалните странични пикове.
При четенето обърнете внимание на три неща. Първо, формата на пика: силно изкривен пик (tailing) или разширена основа могат да указват за съвместно елуиращи примеси или проблеми с колоната. Второ, малките странични пикове: те представляват странични продукти от синтеза; сумата от техните площи дава липсващия процентен дял до маркера от 100%. Трето, базовата линия: тя трябва да протича плоско и спокойно, без дрейф. Накрая интегрирането, тоест изчислителното определяне на площта под всеки пик, дава процентните числа. Подвижна фаза, съдържаща TFA, при това подобрява остротата на пика, тъй като TFA като йонообразуващ реагент маскира основните странични вериги на пептида и така създава по-хомогенно поведение при елуиране (Mant et al., 2007).
Едно отделно процентно число без контекст струва малко, защото зависи от метода. Една и съща проба може да даде леко различни стойности върху две различни колони или при две дължини на вълната на детекция, тъй като разделянето и UV поглъщането на страничните компоненти варират. Чистота от 99%, измерена само при една дължина на вълната, убеждава едва тогава, когато методът е напълно документиран и съответната хроматограма е приложена. Голо число без спектър не може да бъде проверено.
Към това се добавя, че HPLC чистотата не регистрира UV-неактивните съставки. Соли от процеса на синтез и пречистване, например ацетатни или трифлуороацетатни противойони, както и остатъчна вода допринасят за масата, без да се появяват в хроматограмата. Затова нетното съдържание на пептид, често определено чрез аминокиселинен анализ или определяне на азота, е смислено допълнение: то казва колко чист пептид всъщност се съдържа на милиграм прах. Идентичността (MS), относителната чистота (HPLC) и абсолютното съдържание са три различни въпроса, на които един добър CoA отговаря поотделно.
Всяка серия от синтез е отделен химичен процес със собствени отклонения, поради което един CoA трябва винаги да бъде свързан с конкретна партида. Един общ лист с данни, който би трябвало да важи за всички някога произведени единици на даден продукт, не е доказателство от изпитване, а рекламно твърдение. Едва номерът на партидата върху документа свързва измерените стойности с физическия материал във флакона пред вас. Времето на задържане, мас-спектърът и чистотата важат точно за тази производствена единица.
Това е релевантно и затова, защото профилът на примесите може да се различава между партидите. Една партида може би достига 99,2%, друга 98,6% с леко различен модел на странични пикове. Само свързан с партидата CoA отразява тази реалност. На практика трябва да сверите номера на партидата върху етикета с този върху CoA, да проверите датата на изпитване и да се уверите, че хроматограмата действително е приложена. Ако липсва връзката с партидата или оригиналният лист с данни, данните за чистотата не са проследими, независимо колко високо е числото.
Малките пикове до главния пик не са случайност, а имат определени химични причини. От твърдофазовия синтез произхождат преди всичко делеционни пептиди, при които по време на изграждането е била пропусната една аминокиселина, както и скъсени последователности поради преждевременно прекъсване на веригата. Наред с тях се появяват продукти от непълно деблокиране, при които защитни групи остават върху молекулата, както и продукти от рацемизация с променена стереохимия. Тези сродни съединения често се различават само минимално от целевия пептид и съответно елуират близо до главния пик.
След съхранение могат да се добавят и други продукти от разпад. Според обзора на Lai & Topp, 1999 дезамидирането, разцепването на пептидната връзка, окислението, реакцията на Майар, бета-елиминирането и агрегацията спадат към най-важните химични реакции в твърдо състояние. В хроматограмата такива процеси се проявяват като нови или растящи странични пикове. Затова CoA, изготвен директно след синтеза, документира изходното състояние; действителният профил в изследователската лаборатория зависи допълнително от боравенето и съхранението.
Документираната в CoA чистота важи за момента на измерването, обикновено директно след синтеза и пречистването. Затова изследователските пептиди почти винаги се доставят като лиофилизат, тоест като изсушен чрез замразяване прах, защото отнемането на водата силно забавя хидролитичните и окислителните пътища на разпад. Според Lai & Topp, 1999 химичната стабилност в твърдо състояние се определя в решаваща степен от температурата, остатъчната влага и агрегатното състояние; дори малка остатъчна влага може да ускори агрегацията.
На практика това означава: и най-хубавата стойност от 99% носи малко полза, ако материалът след това се съхранява неправилно. Хладното, сухо и защитено от светлина съхранение на затворения лиофилизат запазва най-дълго документирания в CoA профил. Когато един пептид бъде реконституиран, тоест приведен в разтвор, зависимите от водата реакции на разпад започват да протичат по-бързо и първоначалната хроматограма губи своята валидност. Затова който иска да интерпретира коректно данните за чистотата, трябва да разграничава момента на измерване от момента на употреба: CoA описва състоянието при доставка, а не трайното състояние през целия период на използване.
Една систематична проверка отнема само няколко минути и прави абстрактните стойности осезаеми. Прегледайте документа в следния ред:
Ако някоя от тези точки липсва, CoA е непълен. Особено критична е липсата на оригиналните графики: без хроматограма и спектър числото за чистота остава чисто твърдение. За сметка на това един пълен, свързан с партидата документ с всички сурови данни е най-силният сигнал за качество, който може да носи един изследователски пептид. Той ви позволява сами да проследите твърденията, вместо да разчитате на едно изолирано число.
HPLC чистотата е относителна стойност на площта и казва какъв дял от UV-активните съставки се пада на целевия пептид. Съдържанието на пептид, напротив, показва колко чист пептид се съдържа на милиграм общ прах и отчита също UV-неактивните съставки като соли и остатъчна вода. И двете стойности се допълват взаимно и трябва да се разглеждат поотделно.
Не автоматично, тъй като числото зависи от метода. Една документирана хроматограма при 98% може да бъде по-информативна от голо число от 99% без оригинални данни. Решаващо е чистотата да бъде подкрепена от проследима, свързана с партидата хроматограма и методът на измерване да бъде ясно посочен.
HPLC разделя само според физикохимичните свойства и показва поведението при разделяне, а не молекулния състав. Две различни молекули биха могли теоретично да елуират по сходен начин. Едва мас-спектрометрията измерва молекулното тегло и потвърждава чрез сравнение с теоретичната стойност, че действително е налице целевият пептид.
Един CoA документира състоянието към момента на изпитване, обикновено директно след синтеза. Той остава валиден като доказателство за произход, но не описва състоянието след дълго или неправилно съхранение. Обърнете внимание на посочена дата на изпитване и имайте предвид, че реалната чистота зависи от условията на съхранение.
Само за изследователски цели. Не е предназначено за консумация от хора. Научна редакция: Dr. Sieglinde Klaus
