Реконституиране на пептиди: ръководство стъпка по стъпка
Dr. Sieglinde Klaus
Научна редакция · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Научна редакция · Bergdorf Bioscience
Реконституирането представлява контролираното разтваряне на лиофилизиран (лиофилно изсушен) изследователски пептид в подходящ разтворител, по правило бактериостатична вода. В лабораторни условия сухото вещество се смесва с точно определено количество течност, така че да се получи бистър разтвор с известна концентрация (mg на ml). Чистата, стерилна работа е тук решаваща, за да се избегнат замърсяване и разграждане на активното вещество.
Изследователските пептиди се доставят като бял, рохкав прах, защото лиофилизацията извлича водата от материала под вакуум и така оставя аморфен, стабилен при съхранение прах. В това сухо състояние типичните химични пътища на разграждане, като хидролиза, деамидиране и окисление, протичат значително по-бавно, отколкото във воден разтвор (Manning et al., 2010). Реконституирането връща този прах обратно в разтвор, който е необходим за по-нататъшната лабораторна работа. Веднага щом обаче се добави вода, химичният часовник започва да тиктака: пептидите в разтвор по принцип са по-малко стабилни от своето лиофилизирано изходно състояние. Затова целта на процедурата е възпроизводима, документирана концентрация при едновременно минимално микробно и механично натоварване. Типичните количества са от 1 до 10 mg пептид на флакон (вайъл), които се разтварят с 1 до 5 ml разтворител. Изборът на обема определя пряко крайната концентрация и трябва да бъде фиксиран преди първото действие. Който планира целевата концентрация предварително, избягва по-късно доразреждане, което води до допълнителни стъпки на пипетиране и оттам до допълнителни източници на грешка. Тези стъпки трябва да се разбират изключително като лабораторна работа с изследователски материал.
За чиста реконституция в лабораторията е полезен кратък, пълен списък с материали, така че работният процес да не се прекъсва. Следните предмети трябва да са на работната повърхност:
Тънкият калибър на иглата от 29 до 31 G намалява размера на отвора в гуменото септо и оттам риска от замърсяване и загуба на обем. Бактериостатичната вода е тук предпочитаният разтворител, защото съдържа 0,9 процента (9 mg на ml) бензилов алкохол като бактериостатичен консервант и така потиска микробното размножаване в разтвора (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Ако вашият запас е изчерпан, можете да поръчате бактериостатична вода. Който все още не е запознат с основите на този клас вещества, ще намери в ръководството Какво представляват пептидите? обяснителна класификация.
Централната формула е изключително проста: концентрацията се получава от количеството пептид, разделено на добавения обем вода, тоест концентрация (mg на ml) е равна на mg пептид, разделени на ml вода. Флакон с 5 mg пептид, който се разтваря с 2 ml бактериостатична вода, дава съответно 2,5 mg на ml. Ако вместо това се добавят 5 ml, концентрацията спада на 1 mg на ml. Желаната концентрация зависи от това колко фино трябва да бъде по-късното отмерване на количеството: по-ниската концентрация означава по-големи обеми за отмерване и оттам по-малка относителна неточност при пипетиране. Тъй като инсулиновите спринцовки често са скалирани в единици (100 единици са равни на 1 ml), помага концентрацията да се избере така, че необходимите количества да попадат върху четими марки на единиците. Практически пример: при 2 mg на ml 10 единици на инсулиновата спринцовка съответстват точно на 0,1 ml и оттам на 0,2 mg пептид. За да се избегнат грешки в изчисленията и да се изиграят различни сценарии за обема, е разумно използването на цифров помощен инструмент. Калкулаторът за пептиди поема преобразуването между количеството пептид, обема вода и скалата на спринцовката и така намалява риска от грешки при разреждане. Запишете изчислената концентрация директно върху флакона, така че всяко по-късно изтегляне да остане проследимо.
Самият процес на разтваряне следва фиксирана последователност, която защитава както стерилността, така и целостта на пептида. Действайте по следния начин:
Подаването по стъклената стена не е козметична стъпка, а намалява механичното срязващо натоварване и образуването на пяна, което по граничните повърхности въздух-вода благоприятства агрегацията (Zapadka et al., 2017). Силна, директна струя вода може локално да създаде високи срязващи сили и частично да денатурира пептида. Тук търпението е по-важно от темпото. Тези указания се отнасят изключително до работата с изследователски материал в лабораторията.
След добавянето на водата често остава неразтворен материал на дъното или по стената на флакона. Изкушението да се разклаща силно е голямо, но точно това е контрапродуктивно. Механичното натоварване, като разклащане, разбъркване или вортексиране, е установено в научните изследвания средство за целенасочено ускоряване на агрегацията на пептиди и протеини (Zapadka et al., 2017). Разклащането създава безброй малки въздушни мехурчета и оттам огромно увеличена гранична повърхност въздух-вода; тази хидрофобна гранична повърхност благоприятства разгъването и струпването на пептидните молекули. Вместо да разклащате, трябва внимателно да въртите флакона между палеца и показалеца или да го завъртате с бавни кръгови движения. При добре разтворими пептиди често е достатъчно флаконът да се остави да престои няколко минути след добавянето на водата; тогава прахът се разтваря от само себе си. Ако остатък не може да се разтвори, помага повторно внимателно завъртане на интервали, но никога разклащане. Готовият разтвор трябва да бъде бистър и без видими частици, помътняване или пяна. Ако изглежда мътен или се образуват люспи, това показва начеваща агрегация или непълно разтваряне и пробата трябва да се оцени критично. Внимателната работа с материала по този начин не е подробност, а пряка защитна мярка за целостта на молекулата.
Времето за разтваряне зависи силно от аминокиселинната последователност, количеството пептид и избраната концентрация. Добре разтворимите във вода, хидрофилни пептиди често преминават напълно в разтвор в рамките на няколко минути при стайна температура, веднага щом водата е добавена по стената и флаконът се завърта внимателно. Последователности с висок дял хидрофобни аминокиселини, като левцин, валин, фенилаланин или триптофан, се разтварят по-бавно и понякога изискват 15 до 30 минути или повторно внимателно завъртане на интервали от няколко минути. Важно е на процеса да се даде време, вместо да се помага чрез механична сила. Ускореното разтваряне чрез затопляне не е препоръчително, тъй като повишените температури насърчават едновременно няколко пътя на разграждане: деамидирането и хидролизата се ускоряват с покачването на температурата, а и физическата агрегация показва изразена температурна зависимост (Manning et al., 2010). Ако след 30 минути и няколко интервала на завъртане остане видим неразтворен материал, обемът може леко да се увеличи, за да се понижи концентрацията, или пробата се документира като непълно разтворена. Напълно реконституираният разтвор е оптически бистър; всяко трайно помътняване трябва да се разбира като предупредителен сигнал. Планирайте времевия резерв за разтварянето от самото начало във вашия експериментален процес.
Веднага щом пептидът е в разтвор, неговата стабилност значително спада и условията на съхранение стават решаващ фактор. Реконституираният разтвор трябва да се съхранява хладен, тъмен и добре затворен, обикновено в хладилник при 2 до 8 градуса по Целзий. Съдържащият се в бактериостатичната вода бензилов алкохол потиска растежа на бактериите и така удължава полезния период на отворения разтвор, но не замества чистата работа (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). За по-дългосрочно съхранение замразяването е опция, но с едно важно ограничение: всеки цикъл на замразяване и размразяване натоварва пептида механично и химично. Изследвания върху протеинови разтвори показват, че всеки допълнителен цикъл на замразяване и размразяване повишава броя на частиците и оттам образуването на агрегати в пробата (Hauptmann et al., 2018). Практическото следствие гласи: разделете разтвора преди замразяването на малки еднократни аликвоти, така че за всяка употреба да се размразява само един аликвот и да отпадне повторното замразяване. Допълнително защитете флаконите от светлина и обозначете всеки с концентрация и дата. При размразяване се препоръчва бавно затопляне в хладилника, вместо в топла водна баня, за да се избегнат температурни шокове. Който спазва тези правила, поддържа разграждането ниско през целия период на употреба.
Защитата от замърсяване не започва едва при промушването, а вече при подготовката на работната повърхност. Почистете работното място, поставете всички материали под ръка и дезинфекцирайте всяко гумено септо преди всяко отделно промушване с пресен тампон със спирт (70 процента изопропанол), който оставяте да изсъхне за кратко. Използвайте за всяко изтегляне стерилна игла и избягвайте да прокарвате една и съща игла многократно през различни септи, тъй като това може да пренесе микроорганизми. Никога не докосвайте върха на иглата или конуса на спринцовката с пръсти. Консервантът бензилов алкохол наистина потиска растежа на бактериите, но тази защита е ограничена и не е разрешение за нечиста работа; бактериостатичното действие не убива наличните микроорганизми, а само забавя тяхното размножаване (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Освен това трябва да се отбележи, че бензиловият алкохол не е безобиден: исторически той е бил свързван при недоносени бебета с така наречения синдром на задъхване (gasping syndrome), тежка токсична реакция вследствие на висока експозиция на бензилов алкохол (Gershanik et al., 1982). Това подчертава, че бактериостатичната вода е лабораторен реагент със собствен профил на безопасност и се използва изключително за работа с изследователски материал. Документирайте всяко изтегляне, за да поддържате целостта на пробата проследима през целия ѝ период на употреба.
Много проблеми при реконституцията могат да се сведат до малък брой повтарящи се грешки, които могат да се избегнат с малко внимание. Най-честите са:
Който системно обработва тези точки, получава възпроизводимо бистри разтвори с документирана концентрация. Кратък контролен списък на работната повърхност помага да не се пропусне нито една стъпка, особено когато няколко флакона се обработват в серия. Комбинацията от правилно изчисление на количеството, внимателна работа с материала и последователна стерилност образува основата на всяка чиста лабораторна работа с изследователски пептиди.
В лабораторията обикновено се използва бактериостатична вода, тъй като нейното съдържание от 0,9 процента бензилов алкохол потиска микробното размножаване в отворения разтвор. За някои хидрофобни или трудно разтворими последователности може да са необходими различни разтворители. Изборът трябва винаги да се ориентира към профила на разтворимост на съответния пептид.
Концентрацията се получава от mg пептид, разделени на ml вода. Флакон от 5 mg с 2 ml вода дава 2,5 mg на ml. Калкулаторът за пептиди поема това преобразуване заедно със скалата на инсулиновата спринцовка и намалява грешките в изчисленията.
Разклащането създава много въздушни мехурчета и увеличава граничната повърхност въздух-вода, на която пептидите по-лесно агрегират. Внимателното въртене или завъртане разтваря праха също толкова добре, но защитава молекулната структура. Механичното натоварване дори се използва целенасочено в проучвания, за да се ускори агрегацията.
В разтвор пептидите са значително по-малко стабилни, отколкото като прах. Охладен разтвор (2 до 8 градуса по Целзий) трябва да се използва бързо; за по-дълго съхранение се замразява в еднократни аликвоти, за да се избегнат повторни цикли на замразяване и размразяване. Точният профил зависи от последователността.
Само за изследователски цели. Не е предназначено за консумация от хора. Научна редакция: Dr. Sieglinde Klaus
