Leggere correttamente purezza HPLC e CoA dei peptidi
Dr. Sieglinde Klaus
Redazione scientifica · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Redazione scientifica · Bergdorf Bioscience
La purezza HPLC indica quale percentuale dell'area di un cromatogramma è attribuibile al peptide bersaglio, mentre il Certificate of Analysis (CoA) documenta questo valore insieme all'identità confermata tramite spettrometria di massa, al lotto e ai metodi di analisi. Un valore >=99% significa che, nel segnale del rivelatore UV, solo un'area molto ridotta è attribuibile a componenti secondari. Questa guida spiega come nascono entrambe le indicazioni e come verificarle.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) separa una miscela peptidica disciolta in base alle proprietà fisico-chimiche e rende così visibile da quanti componenti è costituito un campione. Nell'analisi dei peptidi domina l'HPLC a fase inversa (RP-HPLC) su colonne C18, C8 o C4, perché separa le molecole in base alla loro idrofobicità offrendo al contempo un'elevata risoluzione. Secondo la rassegna metodologica di Mant et al., 2007, da oltre 25 anni l'HPLC è considerata la tecnica più versatile per l'isolamento e la determinazione della purezza dei peptidi sintetici.
In concreto, una fase mobile, di solito un gradiente di acqua e acetonitrile con lo 0,05-0,1% di acido trifluoroacetico (TFA), scorre attraverso la colonna. Ogni componente lascia la colonna in un momento caratteristico, il tempo di ritenzione, e genera un picco sul rivelatore UV (tipicamente a 214 o 220 nm, dove assorbe il legame peptidico). L'HPLC quindi non misura l'identità di una sostanza, bensì il suo comportamento di separazione e la sua quantità relativa. Per affermare qualcosa sull'identità serve un secondo metodo, la spettrometria di massa.
L'indicazione percentuale della purezza HPLC descrive la quota di area del picco principale rispetto all'area totale di tutti i picchi rilevati. Con il 99%, dunque, il 99% dell'area integrata del segnale UV è attribuibile al peptide bersaglio e solo l'1% all'insieme di tutti i componenti secondari. È importante sottolineare che si tratta di un'indicazione relativa di area, non di un'indicazione di peso: solventi residui, sali o acqua, che a 214 nm assorbono poco, non entrano in questo valore. Per questo i produttori seri integrano la purezza HPLC con ulteriori parametri come il contenuto peptidico netto.
I componenti secondari provengono per lo più dalla sintesi in fase solida. Secondo Boysen & Hearn, 2006, nella sintesi a passaggi successivi si formano soprattutto sequenze di delezione (un amminoacido mancante), sequenze troncate e prodotti derivanti da deprotezione incompleta o da racemizzazione. Sono proprio queste impurezze chimicamente molto simili a essere difficili da separare e a determinare quale livello di purezza sia raggiungibile. Un salto dal 95% al 99% significa quindi che questi composti affini sono stati in gran parte rimossi. Per maggiori approfondimenti sulla classe di sostanze in sé, consulta la guida Cosa sono i peptidi?.
Un CoA è il protocollo di analisi di un lotto specifico e riunisce in un unico documento i risultati di tutte le analisi effettuate. Tipicamente riporta il nome del prodotto, la formula bruta e il peso molecolare teorico, il numero di lotto, la data di produzione o di analisi e i metodi applicati. Il nucleo è costituito da due blocchi: la conferma dell'identità tramite spettrometria di massa e la determinazione della purezza tramite HPLC. Spesso sono indicati anche l'aspetto (liofilizzato bianco) e il contenuto d'acqua.
È decisivo che un CoA attendibile mostri i dati originali e non si limiti ad affermare un numero. A questo appartengono il cromatogramma HPLC riportato, con tempo di ritenzione e aree di integrazione, nonché lo spettro di massa con il valore m/z misurato. In questo modo una persona competente può verificare le affermazioni, anziché limitarsi a crederle. Le indicazioni sui metodi dovrebbero essere precise, ad esempio il tipo di colonna, il gradiente, la lunghezza d'onda di rilevazione e la tecnica di ionizzazione utilizzata. In BergdorfBio il CoA riferito al lotto funge da prova dell'impegno sulla purezza HPLC >=99% e sul CoA indicato in homepage. Prodotti come BPC-157 o Retatrutide vengono forniti ciascuno con un documento di questo tipo relativo al lotto.
Mentre l'HPLC mostra solo il comportamento di separazione, la spettrometria di massa risponde alla domanda se sia presente la molecola corretta. Nell'analisi dei peptidi domina la ionizzazione electrospray (ESI), una tecnica di ionizzazione delicata che trasferisce le molecole in fase gassosa senza frammentarle. Secondo Banerjee & Mazumdar, 2012, l'ESI genera ioni con cariche multiple, ampliando notevolmente l'intervallo m/z misurabile e permettendo di determinare con precisione anche peptidi di grandi dimensioni.
Nel CoA il peso molecolare misurato viene confrontato con il valore teorico calcolato dalla formula bruta. Se entrambi coincidono a meno di poche unità di massa, l'identità del peptide è confermata. Una deviazione, ad esempio di 18 unità di massa, potrebbe indicare una perdita d'acqua, mentre una differenza maggiore potrebbe indicare una sequenza errata o contaminata. L'accoppiamento dei due metodi, ovvero la LC-MS, è particolarmente significativo: Toll et al., 2005 hanno dimostrato che oltre 50 peptidi di una digestione triptica possono essere separati in 15-20 minuti e contemporaneamente identificati tramite ESI-MS. Identità e purezza vengono così rilevate in un'unica corsa analitica.
Il cromatogramma è il messaggio grafico centrale di ogni CoA: sull'asse x è riportato il tempo in minuti, sull'asse y la risposta del rivelatore, di solito in milliunità di assorbanza (mAU). Il peptide bersaglio compare come un picco principale alto e stretto al suo tempo di ritenzione caratteristico, ad esempio tra gli 8 e i 12 minuti a seconda del metodo. Un campione preparato in modo accurato mostra un unico picco netto e simmetrico, con una chiara separazione dalla linea di base rispetto a eventuali picchi secondari.
Nella lettura prestate attenzione a tre aspetti. Primo, la forma del picco: un picco fortemente asimmetrico (tailing) o una base allargata possono indicare impurezze coeluenti o problemi della colonna. Secondo, i piccoli picchi secondari: rappresentano i sottoprodotti di sintesi; la somma delle loro aree dà la percentuale mancante per arrivare al 100%. Terzo, la linea di base: dovrebbe essere piatta e stabile, senza deriva. L'integrazione, ovvero la determinazione matematica dell'area sotto ciascun picco, fornisce infine le percentuali. Una fase mobile contenente TFA migliora la nitidezza dei picchi, poiché il TFA, come reagente di accoppiamento ionico, maschera le catene laterali basiche del peptide generando così un comportamento di eluizione più omogeneo (Mant et al., 2007).
Una singola indicazione percentuale priva di contesto vale poco, perché dipende dal metodo. Lo stesso campione può fornire valori leggermente diversi su due colonne differenti o a due lunghezze d'onda di rilevazione, dato che la separazione e l'assorbimento UV dei componenti secondari variano. Una purezza del 99%, misurata a una sola lunghezza d'onda, convince soltanto quando il metodo è documentato per intero e il cromatogramma corrispondente è allegato. Un numero nudo senza spettro non è verificabile.
A ciò si aggiunge che la purezza HPLC non rileva i componenti non attivi all'UV. I sali derivanti dal processo di sintesi e purificazione, ad esempio i controioni acetato o trifluoroacetato, e l'acqua residua aggiungono massa senza comparire nel cromatogramma. Per questo il contenuto peptidico netto, spesso determinato tramite analisi amminoacidica o determinazione dell'azoto, è un'integrazione utile: indica quanto peptide puro è effettivamente contenuto per milligrammo di polvere. Identità (MS), purezza relativa (HPLC) e contenuto assoluto sono tre domande diverse, a cui un buon CoA risponde separatamente.
Ogni serie di sintesi è un processo chimico a sé, con le proprie fluttuazioni, motivo per cui un CoA deve sempre essere associato a un lotto specifico. Una scheda tecnica generica, destinata a valere per tutte le unità di un prodotto mai prodotte, non è una prova di analisi, ma un'affermazione pubblicitaria. Solo il numero di lotto sul documento collega i valori misurati al materiale fisico presente nel flaconcino davanti a voi. Il tempo di ritenzione, lo spettro di massa e la purezza valgono esattamente per quella unità di produzione.
Questo è rilevante anche perché il profilo delle impurezze può variare tra un lotto e l'altro. Un lotto raggiunge magari il 99,2%, un altro il 98,6% con un quadro di picchi secondari leggermente diverso. Solo un CoA legato al lotto rispecchia questa realtà. In pratica, dovreste confrontare il numero di lotto sull'etichetta con quello riportato sul CoA, controllare la data di analisi e assicurarvi che il cromatogramma sia effettivamente allegato. Se manca il riferimento al lotto o la scheda dati originale, l'indicazione di purezza non è verificabile, indipendentemente da quanto sia alto il numero.
I piccoli picchi accanto al picco principale non sono casuali, ma hanno cause chimiche ben definite. Dalla sintesi in fase solida derivano soprattutto i peptidi di delezione, in cui durante la costruzione è stato omesso un amminoacido, e le sequenze troncate dovute a un'interruzione prematura della catena. Accanto a essi compaiono prodotti di deprotezione incompleta, in cui restano gruppi protettori sulla molecola, nonché prodotti di racemizzazione con stereochimica alterata. Questi composti affini si differenziano spesso solo in minima parte dal peptide bersaglio ed eluiscono di conseguenza vicino al picco principale.
Dopo la conservazione possono aggiungersi ulteriori prodotti di degradazione. Secondo la rassegna di Lai & Topp, 1999, la deamidazione, la scissione del legame peptidico, l'ossidazione, la reazione di Maillard, la beta-eliminazione e l'aggregazione sono tra le più importanti reazioni chimiche allo stato solido. Nel cromatogramma tali processi si manifestano come picchi secondari nuovi o in crescita. Un CoA redatto subito dopo la sintesi documenta quindi lo stato iniziale; il profilo effettivo nel laboratorio di ricerca dipende inoltre dalla manipolazione e dalla conservazione.
La purezza documentata sul CoA vale per il momento della misurazione, di solito subito dopo la sintesi e la purificazione. I peptidi per la ricerca vengono perciò forniti quasi sempre come liofilizzato, ovvero come polvere liofilizzata, perché la rimozione dell'acqua rallenta fortemente le vie di degradazione idrolitica e ossidativa. Secondo Lai & Topp, 1999, la stabilità chimica allo stato solido è determinata in modo decisivo dalla temperatura, dall'umidità residua e dallo stato di aggregazione; già una bassa umidità residua può accelerare l'aggregazione.
In pratica questo significa: la più bella indicazione del 99% serve a poco se il materiale viene poi conservato in modo improprio. Una conservazione del liofilizzato sigillato in luogo fresco, asciutto e al riparo dalla luce mantiene il più a lungo possibile il profilo documentato sul CoA. Quando un peptide viene ricostituito, ovvero portato in soluzione, le reazioni di degradazione dipendenti dall'acqua iniziano a procedere più rapidamente e il cromatogramma originale perde la sua validità. Chi vuole interpretare correttamente i dati di purezza deve quindi distinguere il momento della misurazione da quello dell'utilizzo: il CoA descrive lo stato alla consegna, non lo stato permanente lungo l'intera durata d'uso.
Una verifica sistematica dura solo pochi minuti e rende concreti i valori astratti. Esaminate il documento in questo ordine:
Se manca uno di questi punti, il CoA è incompleto. Particolarmente critica è l'assenza dei grafici originali: senza cromatogramma e spettro, il valore di purezza resta una semplice affermazione. Un documento completo e legato al lotto, con tutti i dati grezzi, è invece il segnale di qualità più forte che un peptide per la ricerca possa offrire. Vi permette di verificare voi stessi le affermazioni, anziché affidarvi a un numero isolato.
La purezza HPLC è un'indicazione relativa di area e dice quale quota dei componenti attivi all'UV è attribuibile al peptide bersaglio. Il contenuto peptidico, invece, indica quanto peptide puro è contenuto per milligrammo di polvere totale, tenendo conto anche dei componenti non attivi all'UV come sali e acqua residua. I due valori si integrano e dovrebbero essere considerati separatamente.
Non automaticamente, poiché il numero dipende dal metodo. Un cromatogramma documentato al 98% può essere più significativo di una nuda indicazione del 99% priva di dati originali. È decisivo che la purezza sia comprovata da un cromatogramma verificabile e riferito al lotto e che il metodo di misurazione sia chiaramente indicato.
L'HPLC separa solo in base alle proprietà fisico-chimiche e mostra il comportamento di separazione, non la composizione molecolare. Due molecole diverse potrebbero teoricamente eluire in modo simile. Solo la spettrometria di massa misura il peso molecolare e conferma, tramite confronto con il valore teorico, che sia effettivamente presente il peptide bersaglio.
Un CoA documenta lo stato al momento dell'analisi, di solito subito dopo la sintesi. Resta valido come prova di provenienza, ma non descrive lo stato dopo una conservazione lunga o impropria. Prestate attenzione a una data di analisi indicata e tenete presente che la purezza reale dipende dalle condizioni di conservazione.
Solo per scopi di ricerca. Non destinato al consumo umano. Redazione scientifica: Dr. Sieglinde Klaus
