Ricostituire i peptidi: guida passo passo
Dr. Sieglinde Klaus
Redazione scientifica · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Redazione scientifica · Bergdorf Bioscience
La ricostituzione descrive la dissoluzione controllata di un peptide da ricerca liofilizzato (essiccato per congelamento) in un solvente adatto, di norma acqua batteriostatica. In laboratorio la sostanza secca viene addizionata con una quantità definita di liquido, in modo da ottenere una soluzione limpida con una concentrazione nota (mg per ml). Lavorare in modo pulito e sterile è qui determinante per evitare contaminazioni e degradazione del principio attivo.
I peptidi da ricerca vengono forniti come polvere bianca e leggera, perché la liofilizzazione sottrae al materiale l'acqua sotto vuoto, lasciando così una polvere amorfa e stabile alla conservazione. In questo stato secco le tipiche vie di degradazione chimica come l'idrolisi, la deamidazione e l'ossidazione procedono molto più lentamente che in soluzione acquosa (Manning et al., 2010). La ricostituzione riporta questa polvere in una soluzione, necessaria per la successiva manipolazione in laboratorio. Non appena si aggiunge l'acqua, però, l'orologio chimico inizia a scorrere: i peptidi in soluzione sono in linea di principio meno stabili rispetto al loro stato liofilizzato di partenza. L'obiettivo della procedura è quindi una concentrazione riproducibile e documentata, con il minor carico microbico e meccanico possibile. Le quantità tipiche vanno da 1 a 10 mg di peptide per flaconcino (vial), da disciogliere con 1 a 5 ml di solvente. La scelta del volume determina direttamente la concentrazione finale e dovrebbe essere stabilita prima del primo gesto. Chi pianifica in anticipo la concentrazione obiettivo evita successive diluizioni, che comportano ulteriori passaggi di pipettaggio e quindi ulteriori fonti di errore. Questi passaggi vanno intesi esclusivamente come manipolazione di materiale da ricerca in laboratorio.
Per una ricostituzione pulita in laboratorio è utile avere una breve lista completa dei materiali, così che il flusso di lavoro non venga interrotto. I seguenti oggetti vanno tenuti sul piano di lavoro:
Lo spessore fine dell'ago, da 29 a 31 G, riduce le dimensioni del punto di puntura nel setto di gomma e quindi il rischio di contaminazione e di perdita di volume. L'acqua batteriostatica è qui il solvente preferito perché contiene lo 0,9 percento (9 mg per ml) di alcol benzilico come conservante batteriostatico, inibendo così la proliferazione microbica nella soluzione (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Se la vostra scorta è esaurita, potete ordinare acqua batteriostatica. Chi non ha ancora familiarità con i fondamenti di questa classe di sostanze trova un inquadramento nella guida Cosa sono i peptidi?.
La formula centrale è quanto mai semplice: la concentrazione risulta dalla quantità di peptide divisa per il volume di acqua aggiunto, ovvero concentrazione (mg per ml) uguale mg di peptide diviso ml di acqua. Un vial con 5 mg di peptide, disciolto con 2 ml di acqua batteriostatica, dà quindi 2,5 mg per ml. Se invece si aggiungono 5 ml, la concentrazione scende a 1 mg per ml. La concentrazione desiderata dipende da quanto fine debba essere la successiva misurazione delle quantità: una concentrazione più bassa significa volumi da misurare più grandi e quindi una minore imprecisione relativa di pipettaggio. Poiché le siringhe da insulina sono spesso graduate in unità (100 unità uguale 1 ml), aiuta scegliere la concentrazione in modo che le quantità necessarie cadano su tacche di unità leggibili. Un esempio pratico: a 2 mg per ml, 10 unità sulla siringa da insulina corrispondono esattamente a 0,1 ml e quindi a 0,2 mg di peptide. Per evitare errori di calcolo e simulare diversi scenari di volume, è sensato ricorrere a uno strumento digitale. Il calcolatore di peptidi si occupa della conversione tra quantità di peptide, volume d'acqua e graduazione della siringa, riducendo così il rischio di errori di diluizione. Annotate la concentrazione calcolata direttamente sul vial, in modo che ogni prelievo successivo resti tracciabile.
Il vero e proprio processo di dissoluzione segue un ordine fisso, che protegge sia la sterilità sia l'integrità del peptide. Procedete come segue:
Il far scendere l'acqua lungo la parete di vetro non è un passaggio cosmetico, bensì riduce lo stress meccanico di taglio e la formazione di schiuma, che alle interfacce aria-acqua favorisce l'aggregazione (Zapadka et al., 2017). Un getto d'acqua violento e diretto può generare localmente elevate forze di taglio e denaturare in parte il peptide. La pazienza è qui più importante della velocità. Queste istruzioni si riferiscono esclusivamente alla manipolazione di materiale da ricerca in laboratorio.
Dopo l'aggiunta dell'acqua resta spesso del materiale non disciolto sul fondo o sulla parete del vial. La tentazione di agitare con forza è grande, ma è proprio questo a essere controproducente. Lo stress meccanico come l'agitazione, la mescolatura o il vortexing è nella ricerca un mezzo consolidato per accelerare in modo mirato l'aggregazione di peptidi e proteine (Zapadka et al., 2017). Agitare genera innumerevoli piccole bolle d'aria e quindi un'interfaccia aria-acqua enormemente ingrandita; questa interfaccia idrofobica favorisce lo spiegamento e l'aggregazione delle molecole di peptide. Invece di agitare, dovreste far rotolare delicatamente il vial tra pollice e indice o roteare con lenti movimenti circolari. Con peptidi ben solubili spesso è sufficiente lasciare riposare il vial alcuni minuti dopo l'aggiunta dell'acqua; la polvere si discioglie poi da sola. Se un residuo non si discioglie, aiuta roteare di nuovo con cautela a intervalli, ma mai agitare. Una soluzione finita dovrebbe essere limpida e priva di particelle visibili, torbidità o schiuma. Se appare torbida o si formano fiocchi, ciò indica un'aggregazione incipiente o una dissoluzione incompleta, e il campione dovrebbe essere valutato in modo critico. Una manipolazione delicata non è quindi un dettaglio, ma una misura di protezione diretta per l'integrità della molecola.
Il tempo di dissoluzione dipende fortemente dalla sequenza amminoacidica, dalla quantità di peptide e dalla concentrazione scelta. I peptidi idrofili, ben solubili in acqua, vanno spesso completamente in soluzione entro pochi minuti a temperatura ambiente, una volta aggiunta l'acqua lungo la parete e roteato delicatamente il vial. Le sequenze con un'alta percentuale di amminoacidi idrofobici come leucina, valina, fenilalanina o triptofano si disciolgono più lentamente e richiedono talvolta da 15 a 30 minuti, oppure ripetute roteazioni delicate a distanza di alcuni minuti. È importante dare tempo al processo, invece di forzare con violenza meccanica. Accelerare la dissoluzione tramite riscaldamento non è consigliabile, poiché temperature più elevate favoriscono contemporaneamente diverse vie di degradazione: la deamidazione e l'idrolisi accelerano con l'aumento della temperatura, e anche l'aggregazione fisica mostra una marcata dipendenza dalla temperatura (Manning et al., 2010). Se dopo 30 minuti e diversi intervalli di roteazione resta materiale visibilmente non disciolto, si può aumentare leggermente il volume per abbassare la concentrazione, oppure il campione viene documentato come disciolto in modo incompleto. Una soluzione completamente ricostituita è otticamente limpida; ogni torbidità persistente dovrebbe essere intesa come un segnale di allarme. Pianificate fin dall'inizio il margine di tempo per la dissoluzione nel vostro protocollo sperimentale.
Una volta che il peptide è in soluzione, la sua stabilità diminuisce nettamente e le condizioni di conservazione diventano il fattore decisivo. La soluzione ricostituita dovrebbe essere conservata al fresco, al buio e ben chiusa, di norma in frigorifero a 2 - 8 gradi Celsius. L'alcol benzilico contenuto nell'acqua batteriostatica inibisce la crescita batterica e prolunga così l'intervallo di tempo utilizzabile della soluzione aperta, ma non sostituisce un modo di lavorare pulito (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Per la conservazione a più lungo termine il congelamento è un'opzione, ma con una limitazione importante: ogni ciclo di congelamento-scongelamento sollecita il peptide meccanicamente e chimicamente. Studi su soluzioni proteiche mostrano che ogni ulteriore ciclo di congelamento-scongelamento aumenta il numero di particelle e quindi la formazione di aggregati nel campione (Hauptmann et al., 2018). La conseguenza pratica è questa: dividete la soluzione prima del congelamento in piccole aliquote monouso, in modo che per ogni utilizzo venga scongelata una sola aliquota e venga meno il congelamento ripetuto. Proteggete inoltre i vial dalla luce ed etichettate ciascuno con concentrazione e data. Per lo scongelamento si raccomanda un riscaldamento lento in frigorifero invece che in un bagnomaria caldo, per evitare shock termici. Chi rispetta queste regole mantiene basso il degrado per tutta la durata di utilizzo.
La protezione dalla contaminazione non inizia con la puntura, bensì già con la preparazione del piano di lavoro. Pulite la postazione di lavoro, disponete tutti i materiali a portata di mano e disinfettate ogni setto di gomma prima di ogni singola puntura con un tampone alcolico fresco (isopropanolo al 70 percento), lasciandolo asciugare brevemente. Usate per ogni prelievo un ago sterile ed evitate di passare lo stesso ago più volte attraverso setti diversi, poiché ciò può trasportare germi. Non toccate mai con le dita la punta dell'ago o il cono della siringa. Il conservante alcol benzilico inibisce sì la crescita batterica, ma questa protezione è limitata e non è un lasciapassare per un lavoro non pulito; un effetto batteriostatico non uccide i germi presenti, ma ne ritarda soltanto la proliferazione (FDA DailyMed, Bacteriostatic Water USP). Va inoltre considerato che l'alcol benzilico non è innocuo: storicamente è stato associato nei neonati prematuri al cosiddetto gasping syndrome, una grave reazione tossica dovuta a un'elevata esposizione all'alcol benzilico (Gershanik et al., 1982). Questo sottolinea che l'acqua batteriostatica è un reagente di laboratorio con un proprio profilo di sicurezza e viene utilizzata esclusivamente per la manipolazione di materiale da ricerca. Documentate ogni prelievo, per mantenere tracciabile l'integrità del campione per tutta la sua durata di utilizzo.
Molti problemi nella ricostituzione si possono ricondurre a un piccolo numero di errori ricorrenti, che si possono evitare con un po' di attenzione. I più frequenti sono:
Chi elabora sistematicamente questi punti ottiene in modo riproducibile soluzioni limpide con una concentrazione documentata. Una breve lista di controllo sul piano di lavoro aiuta a non saltare alcun passaggio, soprattutto quando si lavorano più vial in serie. La combinazione di un corretto calcolo delle quantità, di una manipolazione delicata e di una sterilità coerente costituisce il fondamento di ogni pulita manipolazione di laboratorio dei peptidi da ricerca.
In laboratorio si utilizza di norma acqua batteriostatica, poiché il suo contenuto dello 0,9 percento di alcol benzilico inibisce la proliferazione microbica nella soluzione aperta. Per alcune sequenze idrofobiche o difficilmente solubili possono essere necessari solventi differenti. La scelta dovrebbe orientarsi sempre al profilo di solubilità del peptide specifico.
La concentrazione risulta da mg di peptide diviso ml di acqua. Un vial da 5 mg con 2 ml di acqua dà 2,5 mg per ml. Il calcolatore di peptidi si occupa di questa conversione, inclusa la graduazione della siringa da insulina, e riduce gli errori di calcolo.
Agitare genera molte bolle d'aria e ingrandisce l'interfaccia aria-acqua, sulla quale i peptidi aggregano più facilmente. Un delicato rotolamento o roteamento discioglie la polvere allo stesso modo, ma protegge la struttura della molecola. Lo stress meccanico viene addirittura impiegato negli studi in modo mirato per accelerare l'aggregazione.
In soluzione i peptidi sono nettamente meno stabili che in polvere. Una soluzione refrigerata (2 - 8 gradi Celsius) dovrebbe essere utilizzata rapidamente; per una conservazione più lunga si congela in aliquote monouso, per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Il profilo esatto dipende dalla sequenza.
Solo per scopi di ricerca. Non destinato al consumo umano. Redazione scientifica: Dr. Sieglinde Klaus
