Conservare i peptidi e durata di conservazione: la guida completa
Dr. Sieglinde Klaus
Redazione scientifica · Bergdorf Bioscience
Dr. Sieglinde Klaus
Redazione scientifica · Bergdorf Bioscience
I peptidi di ricerca liofilizzati rimangono al massimo della stabilità quando vengono conservati asciutti, al buio e congelati: a -20 gradi Celsius per anni, eventualmente a -80 gradi Celsius per la durata di conservazione più lunga. Le soluzioni ricostituite vanno riposte in frigorifero a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius e andrebbero utilizzate entro poche settimane. Congelare e scongelare ripetutamente è il nemico numero uno dell'integrità molecolare.
I peptidi sono brevi catene di amminoacidi, la cui funzione dipende da una struttura chimica precisa. Già lievi processi di degradazione possono ridurre in modo misurabile la purezza di un preparato di ricerca. Le principali vie di decomposizione sono l'idrolisi del legame peptidico, l'ossidazione di residui sensibili come metionina, cisteina e triptofano, nonché la deamidazione di asparagina e glutammina. Queste reazioni procedono tanto più rapidamente quanto maggiore è la presenza di acqua, calore, luce e ossigeno.
In un'ampia rassegna sulla stabilità dei prodotti farmaceutici proteici, Manning et al., 2010 descrivono sia l'instabilità chimica (deamidazione, ossidazione, idrolisi, racemizzazione) sia l'instabilità fisica (aggregazione, precipitazione, denaturazione, adsorbimento alle superfici) come i meccanismi centrali. Aspetto decisivo per la pratica: queste due categorie sono collegate, una molecola alterata chimicamente tende più facilmente all'aggregazione.
Per la conservazione in laboratorio del materiale di ricerca ciò comporta un principio chiaro: rimuovere l'acqua oppure congelare la mobilità delle molecole. I peptidi liofilizzati (essiccati per congelamento) si trovano in una matrice asciutta e vetrosa, nella quale le reazioni di degradazione si arrestano praticamente del tutto. Non appena entra in gioco l'acqua, il conto alla rovescia comincia. Chi vuole massimizzare la durata di conservazione riduce quindi al minimo l'umidità, mantiene bassa la temperatura e limita il contatto con aria e luce per l'intero periodo di stoccaggio.
La forma più stabile di un peptide di ricerca è la polvere liofilizzata. Durante la liofilizzazione l'acqua viene rimossa sotto vuoto, in modo che si formi una matrice amorfa e vetrosa che fissa fisicamente le molecole e rallenta drasticamente i processi idrolitici e ossidativi. Wang, 200000423-3) descrive nella sua influente rassegna come spesso le proteine debbano essere trasformate in forma solida per raggiungere una durata di conservazione accettabile, e come la temperatura di stoccaggio debba collocarsi nettamente al di sotto della temperatura di transizione vetrosa.
Per la pratica in laboratorio vale quanto segue: la polvere liofilizzata si conserva a -20 gradi Celsius, il che per la maggior parte delle sequenze consente una stabilità di diversi anni. Per i peptidi particolarmente sensibili, come quelli con residui di cisteina o metionina, oppure per una conservazione pianificata su più anni, è preferibile -80 gradi Celsius, poiché qui la degradazione rimane pressoché trascurabile.
Importante è un recipiente chiuso ermeticamente. L'umidità residua è il fattore critico: già piccole quantità d'acqua riducono la stabilità chimica, motivo per cui il flaconcino originale dovrebbe restare chiuso e un essiccante nel contenitore di conservazione può rivelarsi utile. Evitate inoltre i congelatori senza brina (No-Frost), poiché i loro cicli automatici di sbrinamento innalzano periodicamente la temperatura, generando così involontari parziali scongelamenti. Etichettate ogni recipiente con sostanza, lotto e data di ingresso, affinché la durata di conservazione resti tracciabile. Una temperatura costante e bassa, priva di oscillazioni, vale più di un valore occasionalmente ancora più basso.
Non appena un peptide è stato ricostituito con acqua batteriostatica, abbandona la sua forma asciutta protettiva e si ritrova nuovamente in un ambiente acquoso, in cui idrolisi e ossidazione procedono attivamente. La soluzione ricostituita va perciò riposta in frigorifero a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius e non dovrebbe restare a temperatura ambiente. In questo intervallo di temperatura molti peptidi rimangono utilizzabili per alcune settimane, a seconda della sequenza e della sensibilità.
L'aggiunta batteriostatica agisce in modo decisivo: l'acqua batteriostatica contiene lo 0,9 percento di alcol benzilico, che inibisce la crescita microbica e rende quindi sensato in primo luogo conservare la soluzione in frigorifero per più settimane. L'acqua pura senza conservanti non offre questa protezione. La procedura precisa per lo scioglimento è illustrata nella nostra guida sulla ricostituzione dei peptidi.
La chimica del tampone influenza la stabilità in modo misurabile. Ossidazione e deamidazione dipendono dal pH e dalla temperatura: Manning et al., 2010 mostrano che la deamidazione procede per catalisi basica e si verifica in modo particolarmente rapido nelle sequenze con asparagina-glicina, mentre l'ossidazione della metionina raggiunge il suo massimo nell'intervallo neutro. Per la pratica di laboratorio ciò significa: mantenere al fresco, proteggere dalla luce, consentire il minor contatto possibile con l'aria e non conservare la soluzione più a lungo del necessario. Chi ricostituisce quantità maggiori dovrebbe valutare la suddivisione in aliquote, di cui ci occupiamo nella prossima sezione.
Ogni ciclo di congelamento e scongelamento mette sotto stress i peptidi disciolti a livello fisico. Durante il congelamento si formano cristalli di ghiaccio, la cui crescita genera forze meccaniche e costringe le molecole a uno stretto contatto; allo stesso tempo i soluti si concentrano nelle restanti zone liquide, creando localmente condizioni estreme. Il risultato è l'aggregazione e una perdita progressiva di principio attivo intatto.
Jain et al., 2021 hanno studiato in Scientific Reports in modo mirato lo stress da congelamento e scongelamento di un anticorpo monoclonale e hanno dimostrato che l'aggregazione può essere ridotta in modo significativo grazie a condizioni di congelamento e scongelamento ottimizzate. Lo studio fornisce un quadro di riferimento su come ridurre al minimo i danni, dalla scala di laboratorio fino alla produzione. La conclusione trasferibile: non è il congelamento in sé il problema, bensì le condizioni e la frequenza dei cicli.
Nella pratica ciò comporta una regola semplice: limitate il numero dei cicli di congelamento e scongelamento. I peptidi brevi e semplici tollerano spesso diversi cicli con perdite ridotte, mentre le sequenze più lunghe e ripiegate in modo più complesso possono subire danni misurabili già dopo due o tre cicli. Un congelamento rapido a -80 gradi Celsius e uno scongelamento veloce a temperatura ambiente mantengono contenuto lo stress all'interno di un singolo ciclo. Chi congela e scongela ripetutamente la stessa soluzione madre accelera inutilmente la degradazione. La soluzione è la suddivisione in aliquote.
La suddivisione in aliquote indica il frazionamento di una soluzione madre ricostituita in più piccole porzioni (aliquote), che vengono congelate separatamente. Invece di scongelare e ricongelare un unico recipiente a ogni prelievo, si scongela solo l'aliquota effettivamente necessaria in quel momento. Ogni flaconcino attraversa così, idealmente, esattamente un solo ciclo di congelamento e scongelamento, anziché molti. Questo principio del singolo scongelamento è considerato, nella pratica di laboratorio, la protezione più efficace contro la degradazione dovuta ai cicli di congelamento e scongelamento.
La ragione risiede nella disomogeneità della degradazione: ogni scongelamento è un'occasione per una degradazione parziale, un'aggregazione o un adsorbimento alla parete del recipiente, e queste alterazioni non si distribuiscono in modo uniforme su tutte le molecole. Suddividendo precocemente la soluzione madre in porzioni, si congela la maggior parte del materiale nel suo stato di partenza definito. La raccomandazione di Jain et al., 2021 di controllare le condizioni di congelamento e scongelamento si traduce così direttamente in un semplice protocollo di lavoro.
In pratica, la soluzione si suddivide in microprovette sterili ed etichettate, le cui dimensioni si orientano al consumo abituale per esperimento. Utilizzate recipienti a basso legame proteico per ridurre le perdite per adsorbimento, e non riempite fino all'orlo, poiché il liquido che congela si espande. Etichettate ogni aliquota con sostanza, concentrazione e data. I residui non utilizzati di un'aliquota scongelata vengono eliminati anziché ricongelati. In questo modo la scorta principale conserva una qualità costante per mesi, mentre solo piccole quantità vengono esposte allo stress dello scongelamento.
Oltre ad acqua e calore, luce e ossigeno sono due fattori di degradazione spesso sottovalutati. L'ossidazione riguarda soprattutto i residui solforati metionina e cisteina, nonché il triptofano aromatico. La metionina si ossida a metionina solfossido e oltre a solfone, e questa trasformazione è praticamente irreversibile. L'ossigeno dell'aria e la luce accelerano questo processo, motivo per cui il contatto con entrambi andrebbe ridotto al minimo.
Badgett et al., 2017 hanno dimostrato mediante spettrometria di massa HILIC che i peptidi con metionina ossidata e asparagina deamidata possono essere separati e quantificati in modo netto dai loro corrispondenti inalterati. Ciò dimostra che queste modifiche sono alterazioni reali e misurabili, non rischi teorici. Per la conservazione ne deriva che ogni misura volta a ridurre l'esposizione a luce e aria preserva la quota intatta.
Concretamente ciò significa: conservate i peptidi in contenitori opachi o color ambra, oppure nella loro confezione di cartone originale, lontano dalla luce delle finestre e dalle fonti UV. Tenete il recipiente chiuso tra un prelievo e l'altro, per limitare il contatto con l'aria. Per le sequenze particolarmente soggette a ossidazione, la copertura con un gas inerte come azoto o argon può spostare l'ossigeno residuo nello spazio di testa del recipiente. In combinazione con bassa temperatura e secchezza, la protezione da luce e ossigeno costituisce un concetto di protezione completo, che prolunga sensibilmente la durata utile del materiale di ricerca.
Le sostanze ausiliarie (eccipienti) presenti nel prodotto liofilizzato contribuiscono in misura sostanziale alla stabilità di conservazione. I disaccaridi come trealosio e saccarosio sono considerati i lioprotettori più efficaci: formano legami a idrogeno con i gruppi polari del peptide, sostituendo così il ruolo stabilizzante dell'acqua rimossa nella matrice vetrosa. Karunnanithy et al., 2024 riferiscono che il trealosio in questo dà spesso risultati migliori rispetto al saccarosio, poiché la sua rotazione molecolare più lenta disturba meno la struttura proteica.
Altrettanto decisiva è l'umidità residua del liofilizzato finito. Una bassa umidità residua mantiene il prodotto al di sotto della temperatura di transizione vetrosa e quindi nello stato vetroso stabile; se l'umidità aumenta, la stabilità chimica cala indipendentemente dal fatto che il materiale si presenti vetroso o già gommoso. Questi rapporti risalgono al lavoro fondamentale di Wang, 200000423-3), che tratta in modo approfondito la crioprotezione e la lioprotezione.
Per la pratica di conservazione ne derivano diverse leve. Conservate il peptide nel flaconcino originale con il setto integro, per impedire l'assorbimento di umidità. Inserite un essiccante (gel di silice) nel contenitore di conservazione circostante, soprattutto quando i recipienti vengono prelevati dal congelatore, poiché durante il riscaldamento si forma condensa. Lasciate quindi i flaconcini chiusi raggiungere la temperatura ambiente prima di aprirli, affinché nessuna umidità condensi al loro interno. Queste piccole precauzioni proteggono la stabilità a secco faticosamente ottenuta e impediscono che l'umidità penetrata accorci la durata di conservazione.
Un peptide degradato o contaminato si riconosce in parte a occhio nudo, in parte solo per via analitica. Per la polvere liofilizzata vale: un preparato intatto si presenta come una torta omogenea di colore dal bianco al crema, oppure come una polvere fine. Colorazioni anomale, una torta collassata o liquefatta, oppure umidità visibile nel flaconcino sono segnali d'allarme di un ingresso di umidità o di una conservazione impropria.
Dopo la ricostituzione, un campione disciolto correttamente dovrebbe essere limpido e privo di particelle. Torbidità, striature, fiocchi o un precipitato visibile indicano un'aggregazione o una contaminazione microbica, entrambi segnali che il materiale è inadatto a fornire risultati di ricerca affidabili. Come descritto sopra, l'aggregazione è una conseguenza diretta dello stress da congelamento e scongelamento e dell'instabilità fisica, che Manning et al., 2010 indicano come meccanismo centrale.
La valutazione affidabile della purezza avviene tuttavia per via strumentale. Il metodo di Badgett et al., 2017 dimostra che le varianti ossidate e deamidate possono essere separate per via cromatografica dalla specie intatta e quantificate; nella pratica si ricorre a tal fine a HPLC e spettrometria di massa. Le alterazioni visibili sono quindi solo il primo livello grossolano. Per la ricerca quantitativa è consigliabile documentare la data di ingresso, registrare le anomalie visibili e, in caso di dubbio, ricorrere a una caratterizzazione analitica prima che un materiale dubbio entri in un esperimento.
La durata di conservazione realistica dipende fortemente dallo stato del peptide. Come polvere liofilizzata a -20 gradi Celsius molte sequenze rimangono stabili per diversi anni; a -80 gradi Celsius la degradazione è così ridotta che è possibile una conservazione molto lunga. A temperatura ambiente, al contrario, la durata utile si riduce drasticamente, poiché idrolisi e ossidazione procedono in modo nettamente più rapido.
Le soluzioni ricostituite sono notevolmente più effimere. In frigorifero a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius, a seconda della sequenza e della sensibilità, alcune settimane sono considerate un intervallo consueto; i peptidi soggetti a ossidazione o deamidazione si collocano all'estremità inferiore di questa fascia. Proprio per questo la suddivisione precoce in aliquote e il congelamento a -20 o -80 gradi Celsius sono così preziosi: riportano la soluzione effimera in uno stato più duraturo, senza esporla a ripetuti stress da scongelamento.
I valori esatti variano a seconda della sequenza, della formulazione e delle sostanze ausiliarie presenti, motivo per cui Manning et al., 2010 sottolineano che sequenza, residui sensibili e formulazione determinano insieme la stabilità. Considerate quindi le indicazioni sulla durata di conservazione come valori orientativi dipendenti dalla sequenza, non come garanzie fisse. Una buona regola pratica per il laboratorio: a secco e congelato pensate in anni, disciolto e refrigerato pensate in settimane. Chi è incerto al momento dello scioglimento trova le basi nella nostra guida Cosa sono i peptidi? nonché nelle istruzioni dettagliate sulla ricostituzione.
In linea di principio sì, ma ogni ulteriore ciclo di congelamento e scongelamento aumenta il rischio di aggregazione e di perdita di principio attivo. Jain et al., 2021 mostrano che i danni da congelamento e scongelamento possono essere ridotti grazie a condizioni controllate. È tuttavia nettamente meglio suddividere la soluzione in aliquote fin dall'inizio e consentire un unico scongelamento per ogni aliquota.
Per molti peptidi liofilizzati -20 gradi Celsius sono sufficienti, a condizione che l'apparecchio non disponga di un sistema No-Frost con cicli automatici di sbrinamento, poiché questi innalzano periodicamente la temperatura. Per una conservazione pluriennale o per sequenze particolarmente sensibili è preferibile un congelatore a -80 gradi Celsius, perché lì la degradazione si arresta quasi del tutto.
Il vetro freddo attira la condensa al contatto con l'aria ambiente. Se si apre subito un flaconcino gelido, l'umidità raggiunge la polvere e accelera idrolisi e degradazione. Lasciando invece prima acclimatare il recipiente chiuso, il contenuto resta asciutto e la stabilità a secco faticosamente raggiunta viene preservata.
No, l'alcol benzilico contenuto agisce in modo antimicrobico, non come stabilizzante chimico. Impedisce la crescita microbica e rende così sensata la conservazione di una soluzione in frigorifero per più settimane, ma non protegge da idrolisi o ossidazione. Queste continuano a essere controllate mediante refrigerazione, protezione dalla luce e contatto limitato con l'aria.
A seconda della sequenza e della sensibilità, alcune settimane a una temperatura compresa tra 2 e 8 gradi Celsius sono considerate un intervallo consueto. I peptidi soggetti a ossidazione o deamidazione si collocano all'estremità inferiore. Poiché la durata esatta dipende dalla sequenza, si documenta la data di ricostituzione e si eliminano le soluzioni con torbidità o precipitato visibili.
Solo per scopi di ricerca. For research purposes only. Not for human consumption.
Redazione scientifica: Dr. Sieglinde Klaus
Come ricostituire i peptidi da ricerca liofilizzati con acqua batteriostatica: passaggi, calcolo, conservazione. Lavora pulito in laboratorio.
Cosa sono i peptidi? Produzione (SPPS), purezza (HPLC), liofilizzazione. 7 referenze PubMed. Guida scientifica.